Фазовый, элементный, аминокислотный, структурный состав желчных камней

Публикация доступна для обсуждения в рамках функционирования постоянно

действующей интернет-конференции “Бутлеровские чтения”. http:///readings/

УДК 547.93. Поступила в редакцию 11 ноября 2012 г.

Фазовый, элементный, аминокислотный,

структурный состав желчных камней

© Голованова1*+ Ольга Александровна и Астахов2 Александр Николаевич

1 Кафедра неорганической химии. Омский государственный университет им. .

Проспект Мира, 55а. г. Омск, 644077. Омская область. Россия.

Тел.: [phone]. E-mail: [e-mail]

2 НИИ «Нанотехнологии и наноматериалы». Южно-Российский государственный технический университет. Ул. Просвещения, 132. г. Новочеркасск, 346428. Ростовская область. Россия.

_______________________________________________

*Ведущий направление; +Поддерживающий переписку

Ключевые слова: желчные камни, холестерин, билирубин, карбонаты кальция, экстракционного отделения.

Аннотация

В работе изучена серия камней, удаленных оперативным путем у пациентов г. Омска. Методами РФА и ИК-спектроскопии установлено, что основными компонентами желчных камней являются: холестерин (92% от изученной коллекции); холестерина с добавками билирубиновой компоненты (6%); карбонаты кальция различной модификации в холестериновых камнях: арагонит, ватерит, каль-цит (16%) с преобладанием модификации ватерит (9%). Использования экстракционного отделения холестерина позволило получить более полную информацию о составе желчных камней.

Введение

Результатом влияния широкого спектра природных и антропогенных факторов на живой организм является образование патогенных органо-минеральных агрегатов, встречающихся практически во всех органах человека.

Настоящая работа посвящена камням, которые образуются как в самом желчном пузыре, так и в желчных протоках. Желчнокаменная болезнь нередко приводит к утрате трудоспособ-ности. В России этой болезнью страдает около 18% взрослого населения, ежегодно опериру-ется более 60 тысяч человек. В последние годы отмечается тенденция к росту числа заболе-ваний у лиц молодого возраста [1].

Исследование фазового и химического состава, структуры, морфологии желчных кам-ней; механизмов их формирования и преобразования представляет несомненный интерес при поиске новых путей лечения и профилактики желчекаменной болезни (холелитиаза).

Известно, что абсолютное большинство желчных камней имеет сложный вещественный состав [2-10]. В количественном отношении основное значение имеют холестерин и желчные пигменты. Так, количество холестерина в камнях в среднем доходит до 70%, тогда как содер-жание его в желчи составляет едва 2% [11].

Из других компонентов встречаются карбонаты, фосфаты и пальмитат кальция, желчные кислоты и фосфолипиды. Всего в составе желчных камней установлено более двадцати химических элементов. Их количественное содержание для разных регионов существенно варьирует [10, 12]. Известно, что многие из них играют важную роль в обмене веществ, гор-мональных и ферментативных процессах. В целом, имеющиеся по данному вопросу сведения часто не достаточно полны.

Высокое содержание холестерина затрудняет определение компонентов, находящихся в желчных камнях в незначительных количествах.

Образование желчных камней, согласно современным представлениям, является, в основном, результатом дестабилизации физико-химического состояния желчи. Поэтому, актуальной задачей является биохимическое определение качественного и количественного состава желчи, в частности определение главных составляющих: холестерина, суммы желчных кислот с расчётом их соотношений – индексов литогенности [13], а также выявление связей между составами желчных камней и параметрами камнеобразующего раствора (жел-чи), которые практически не исследованы.

Эти данные представляют как научный интерес, так и практический. Они необходимы для понимания процессов зарождения, роста и последующего преобразования желчных камней и могут быть использованы для профилактики ранней стадии холестеринового литогенеза.

Целью настоящей работы являлось устранение этих пробелов. В ее задачи входило детальное изучение вещественного и элементного состава желчных камней жителей одного региона с использованием нового комплексного подхода, а также оценка состава желчи, как камнеобразующей среды.

Экспериментальная часть

В качестве объектов исследования использована коллекция из 75 камней, удаленных опера-тивным путем у пациентов хирургических отделений Областной клинической больницы и Больницы скорой медицинской помощи г. Омска. Желчь для исследования была предоставлена Западно-Сибирским Федеральным Медицинским Центром.

Для получения максимально полной информации о составе исследуемых образцов были экспе-риментально подобраны экстрагенты, позволяющие достичь растворения холестерина и его удаление. В качестве их использовали хлороформ, этанол, их смесь в соотношении 3:1 и метил-трет-бутиловый эфир, а также ацетон. Усредненную пробу желчного камня в количестве 0.1 г растворяли в 5.0 мл растворителя. Наибольший процент извлечения (~98%) был достигнут при использовании в качестве растворителя ацетона. После экстракции для дальнейшего исследования брали 1.5 мг нерастворимого осадка.

Для определения фазового состава использовали дополняющие друг друга методы порошковой рентгенографии (ДРОН-3М, CuKa) и ИК-спектроскопии. Для определения элементного состава желчные камни были подвергнуты анализу на станции энергодисперсионного рентгенофлуоресцентного эле-ментного анализа ВЭПП-3 Центра синхротронного излучения ИЯФ СО РАН (аналитик ). Эмиссионные спектры исследуемых проб возбуждались пучком поляризованного монохромати-зированного излучения энергией 25 кэВ.

Образцы готовили прессованием порошка в таблетки весом 30 мг и диаметром 5 мм с поверх-ностной плотностью 0.15 г/см2. Для количественного определения элементов методом внешнего стан-дарта использовали два уровня энергии возбуждения: 22 кэВ (Ti, V, Cr, Mn, Fe, Ni, Cu, Zn, Ga, As, Se, Br, Rb, Sr, Y, Zr, Nb, Mo, Pb, Th, U) и 42 кэВ (Cd, In, Sn, Sb, Te, I, Cs, Ba, La и Ce). Пределы обнаружения элементов при загрузке спектрометрического тракта с частотой 10 кГц и временем измерения 1000 секунд варьировали в пределах (0.1-2.0)·10-4 % (погрешность определений – 2-5 отн. %).

Элементный состав желчи определяли методом атомно-эмиссионной спектроскопии с индуктивно связанной плазмой (АЭС-ИСП). Измерения проводили на ИПС-спектрометре OPTIMA 2000 DV. При количественном расчете использовали метод градуировочного графика. Пределы обнаружения элементов соответствовали (5-0.1)·10-4мг/кг, относительная погрешность определения всех элементов составляла 1-3 %.

Желчь, перенасыщенная холестерином, склонна к кристаллизации, поэтому ее называют лито-генной. Индекс литогенности (насыщения [14], холато-холестериновый коэффициент) рассчитывали по соотношению желчных кислот и холестерина, как частное от деления количества холестерина, находящегося в желчи, на количество холестерина, которое может быть растворено в ней при данном соотношении желчных кислот и холестерина.

Если индекс литогенности меньше единицы, такая желчь называется ненасыщенной, если больше единицы – перенасыщенной. Для определения концентрации желчных кислот и холестерина в желчи использовали спектрофотометрический метод [15], основанный на способности предварительно охлаждённого 0.1% раствора хлорного железа в смеси равных объёмов ледяной уксусной и концентрированной серной кислот реагировать с холестерином и желчными кислотами.

Анализы проводили на однолучевом спектрофотометре СФ-46 со встроенной микропроцесс-сорной системой. За норму брали следующие средние величины, согласующиеся с приводимыми в литературе данными [15-16]: холестерин – 2.54 ммоль/л, желчные кислоты 61.75 ммоль/л, холатохо-лестериновый коэффициент – 26.5.

Результаты и их обсуждение

1. Морфология и фазовый состав

Морфология исследуемых желчных камней достаточно разнообразна (рис. 1). Присутст-вуют камни овальные (как правило, единичные); имеющие форму «тутовых ягод» с зернис-тым строением внешнего слоя; граненые (фасеточные)- всегда множественные; агрегативные, возникающие при срастании нескольких первичных камней с последующим обрастанием общи-ми слоями, а также «черные образцы», напоминающие по структуре и размерам силикатный песок.

а)	б)
в)	г)
д)	е)

Рис. 1. Морфология желчных камней: а, е) граненых (фасеточных);

б, д) овальных; в, г) в форме тутовых ягод; масштаб

В целом, цвет камней: от светлых оттенков до темно-коричневых и даже черных. Чаще всего масса камней колеблется от 0.5-0.8 до 1.5 г и реже от 3-4 до 8 г, но может быть и гораздо больше (рис. 2).

Рентгенофазовый анализ желчных камней выявил наличие холестерина, в качестве основного компонента, в 90% образцов. После экстракционного удаления холестерина с использованием разработанной методики был определен широкий спектр веществ входящих в состав желчных камней.

Рентгеновским методом после экстракционного удаления холестерина в исследуемых камнях удалось обнаружить различные модификации карбоната кальция: в семи случаях ватерит, в пяти – арагонит или ватерит и кальцит. Методом ИК-спектроскопии дополнительно в желчных камнях (после экстракции холестерина ацетоном) были найдены: билирубин (пигмент) в большинстве образцов (~65%) и натриевая соль желчной кислоты в единичных случаях.

Кроме того, в образовавшихся после эктракции нерастворимых осадках были выявлены карбонаты кальция (арагонит, кальцит): арагонит вместе с пигментом, кальцит с холестери-ном. В двух случаях анализ спектров позволил также установить наличие слоистого алюмосиликата – минерала вермикулита.

Рис. 2. Уникальный желчный камень: размер 3.5х3.6х6.8 см, вес 36 г

Рис. 3. Разрез холестеринового камня, состав периферийной части – билирубиново-холестериновый (реальная величина)

Данные РФА и ИК-спектроскопии «черных камней» показали, что они содержат били-рубин и пальмитат кальция, пики холестерина практически не наблюдаются. При этом оказа-лось, что в исследуемой коллекции есть чисто пигментный камень, что встречается доста-точно редко.

Таким образом, в результате проведенного комплексного исследования было установ-лено, что холестерин присутствует в 92% исследованных камней; холестерин с добавками билирубиновой компоненты в 6%; холестерин с добавками различных модификаций карбо-натов кальция (арагонита, ватерита, кальцита) в16%, с преобладанием ватерита в 9%.

Характерной особенностью желчных камней является значительно более высокое, по сравнению с почечными камнями, содержание органического вещества, что сказывается на особенностях их строения. На рис. 3 представлен моноядерный холестериновый камень с радиально-слоистой структурой. Его ядро представляет собой вероподобный агрегат.

При визуальном исследовании камня видно, что на периферии он имеет радиальную-слоистую, которая может быть образована в результате концентрического наслаивания скры-токристаллического холестерина, либо в результате чередования концентрических колец кристаллического холестерина, где кристаллы ориентированы по радиусам окружности.

Табл. 1. Результаты ИК-спектроскопии различных слоев желчного камня
Камень
До растворения	После экстракции
Часть камня	Обнаруженное вещество	Часть камня	Обнаруженное вещество
Корка	Билирубин Холестерин	Корка	Билирубин Ватерит Пальмитат кальция
Подкорка	Билирубин Холестерин	Подкорка	Билирубин Ватерит
Центр	Холестерин Билирубин Пальмитат кальция	Центр	Состав не изменился

Изучение различных слоев этого камня (корки, подкорки и центра) ме-тодом ИК-спектроскопии представле-но в табл. 1.

Оказалось что фазовый состав коркового и подкоркового слоев прак-тически идентичен. До обработки аце-тоном в них фиксируятся билирубин и холестерин. После проведения экстрак-ции халестеррна наряду с билируби-ном выявляются ватерит и пальмитат кальция. В белом кристаллическом центре камня до проведения обработки ацетоном фиксируются холестерин, билирубин и пальмитат кальция. После обработки фазовый состав не меняется. Можно предположить, что установленное распределение фаз в иссле-дуемом образца связано с физико-химическими свойствами раствора, в котором он образо-вался.

2. Элементный состав

С помощью рентгенофлуоресцентного анализа в составе желчных камней было иден-тифицировано более 36 элементов, доля которых колеблется в диапазоне от 10-5 до 2 % масс.

В группе из тринадцати элементов, доля которых составляет более 10-4 % масс., со-держание убывает в следующем порядке: Ca, K, Mn, Fe, Cu, Pb, Ti, Zn, V, Ni, Bi, Cr, Hg.

Cодержание кальция составляет 95 % масс., калия, находящегося на втором месте, не более 3 % масс., а на долю хрома, находящемся на третьем месте, приходится всего две сотых % масс.

Сравнение полученных результатов с литературными [5] говорит о том, что в желчных камнях кальций всегда является доминирующим элементом. Можно предположить, что именно кальций, образуя устойчивые комплексные соединения с холестерином, может спо-собствовать нарушению метастабильного состояния желчи.

В исследуемой коллекции выделяются три группы образцов, отличающиеся по содер-жанию марганца, железа и меди. Возможно, повышенное содержание этих элементов в желчных камнях связано с экологической обстановкой в Омском регионе.

По данным Обь-Иртышского межрегионального территориального управления по гид-рометеорологии и мониторингу окружающей среды, Иртыш сильно загрязнен соединениями марганца, железа и меди (превышение предельно допустимых концентраций в 44, 24 и 23 раз, соответственно), в Оби концентрации марганца и меди достигают более 100 ПДК [16].

3. Элементный и биохимический состав желчи

Рис. 4. Соотношение элементов в нормальной и патогенной желчи

В результате исследования операционной желчи было выявлено девять элементов, содер-жание которых (более 10-4 % масс.) убывает в следующем порядке: Na Ca P K Mg Fe Zn Cu Mn (рис. 4). При сравнении полученных ре-зультатов с нормой [11], оказалось, что концентрации в патогенной желчи таких элементов, как P, K, Ca и Mg превышают их содержание в норме (в 1.5, 1.5, 2.5, 4.5 раз, соответственно) а содержание железа в 3.5 раза меньше нормы.

По результатам исследования шести образцов пузырной желчи, взятой от боль-ных желчекаменной болезью в момент операций (табл. 2) среднее значение холла-то-холестеринового коэффициента состав-ляет 1.96. Это значение существенно мень-ше критического (10-12) и свидетельст-вует о литогенности исследуемой пузырной желчи. Таким образом, использованный метод определения холестерина и желчных кислот позволяет на основе коэффициента литогенности желчи выявлять людей, предрасположенных к желчнокаменной болезни.

Табл. 2. Результаты анализа желчи

№ желчи	Концентрация желчных кислот в ммоль/л	Концентрация холестерина в ммоль/л	Холато-холестериновый коэффициент К	Среднее значение К
1	3.26	1.56	2.08	1.96
2	5.63	2.54	2.22
3	7.56	7.23	1.05
4	6.99	2.98	2.34
5	10.65	9.23	1.15
6	62.24	21.53	2.89
норма	61.75	2.54	26.5

При сравнении состава желчных камней и желчи можно предположить, что большое количество холестерина в камнях связано, в первую очередь, с нарушением равновесного соотношения компонентов в желчи. Показательным является достаточно высокая концент-рация кальция, как в составе камней, так и в патогенной желчи. Вероятно, кальций играет большую роль в процессе зарождения и образования фаз желчных камней.

Концентрация и содержание элементов в органах и тканях связаны с местом прожи-вания, пищевым рационом и другими условиями. В процессе обмена веществ различное их количество оказывается в желчи и соответственно в желчных камнях.

Выводы

1.  Впервые, в результате комплексного изучения желчных камней с использованием разра-ботанного метода экстракционного отделения холестериновой составляющей, получена детальная информация о составе и распределении компонентов входящих в состав желч-ных камней. Методами РФА и ИК-спектроскопии получено: холестерина – 92% от изу-ченной коллекции; холестерина с добавками билирубиновой компоненты – 6%; карбонаты кальция различной модификации в холестериновых камнях: арагонит, ватерит, кальцит – 16% с преобладанием модификации ватерит (9%).

2.  Проведено послойное исследование желчных камней с использованием экстракционного отделения холестериновой компоненты, что позволило получить дополнительную инфор-мацию о составе желчных камней.

3.  Экспериментально установленное соотношение индекса литогенности пузырной желчи во всех случаях меньше нормы, что свидетельствует о литогенности желчи, в которой про-исходило формирование патогенных образований. Таким образом, изучение состава желчи и желчных камней является очень важным как с точки зрения раскрытия механизма литогенеза, так и выработки диагностических и прогностических критериев в лечении желчекаменной болезни.

Благодарности

Работа выполнена при частичной финансовой поддержке Российского фонда фунда-ментальных исследований (грант №12-03-98011-р_сибирь_а и № 10-05-00881-а) и в рамках реализации ФЦП «Научные инаучно-педагогические кадры инновационной России» на 2009 - 2013 годы (проект №14.В37.27.2037).

Литература

[1]  , , Пятанова аспект патогенного биоминералообразования. Доклады Омского отделения Международной академии наук экологии и безопасности жизнедеятельности. Омск. 2002. Т.2. Вып.1(3). С.81-83.

[2]  M. C. Carey. Pathogenesis of gallstones. Am. rg. 1993. No.4. Р.410-419.

[3]  G. L. Flynn, Y. Shay et al. J. Pharm. Sci. 1979. Vol.68. No.9. Р.1090-1096.

[4]  , Крылова болезнь. М.: Медицина. 1983. 273с.

[5]  Кораго в биоминералогию. Спб.: Недра. 1992. 280с.

[6]  Шелектина представления о генезе и принципах типирования желчных конкрементов. Журн. АМН Украiни. 1996. Т.2. №4. С.631-634.

[7]  , Свиридов взгляд на патогенез желчнокаменной болезни. Клиническая медицина. 1999. №5. С.8-11.

[8]  G. L. Thistle, G. L. Garlson. Gastroenterology. 1980. Vol.78. Р.1016-1022.

[9]  ристаллографические исследования почечных и желчных камней. Кристаллография. 1971. Т.16. Вып.6.

[10]  , , Леонова минерального и микроэлементного составов и их взаимосвязи в желчных камнях. Неорганическая химия. 2003. Т.48. №12. С.2080-2085.

[11]  Северин . М.: “ГЭОТАР-Мед”. 2003. 320с.

[12]  , , Россеева ЛВ. Роль геохимического фона в развитии эндемических заболеваний (Омский регион). Научные чтения им. акад. . 3 Международная конференция "Экогеология-2003". СПб: СПбГУ. 2003. С.7-9.

[13]  , , Казачек содержания желчных кислот и холестерина в желчи. Лаб. Дело. 1978. №3. С.149-153.

[14]  , , Селезнев литогености желчи: методы определения, клиническая доступность, информативность. Клиническая медицина. 1992. №7-8. С.39-41.

[15]  , Шапиро метод определения желчных кислот в дуоденальном содержимом. Здравоохранение. 1973. Вып.2. С.53-56.

[16]  ез очищенной воды нам, товарищи, «кранты»! Комсомольская правда в Омске. 2002.