Доменная структура каталитической субъединицы теломеразы Hansenula polymorpha как основа для структурных исследований

Доменная структура каталитической субъединицы теломеразы Hansenula polymorpha как основа для структурных исследований

,

Московский государственный университет имени ,

Химический факультет, Москва, Россия

E-mail: *****@***ru

Теломераза является ключевым участником системы поддержания длины теломер, защищающих линейные концы хромосом эукариот от деградации и слияния и тем самым поддерживающих стабильность генома. В большинстве соматических клеток теломераза неактивна. Нарушения в работе теломеразы связаны с онкологическими заболеваниями. 85-90% типов раковых клеток имеют активную теломеразу. Таким образом, понимание механизма работы теломеразы и ее регуляции необходимо для разработки новых стратегий лечения онкологических заболеваний за счет ингибирования теломеразной активности и восстановления механизма контроля числа клеточных делений у раковых клеток. Теломераза состоит из каталитической субъединицы, называемой TERT, которая состоит из нескольких функциональных доменов; и РНК-компонента, TER. Полноразмерная TERT в растворе нестабильна и не подходит для структурных исследований. Структура TERT, согласно данным литературы, включает несколько функциональных доменов (N - и С-концевые домены, РНК-связывающий домен, каталитический домен), которые представляют собой перспективные объекты для кристаллизации [1–3]. Целью данной работы было получение стабильных доменов TERT для структурных исследований.

На первом этапе работы с помощью биоинформатического анализа были выбраны участки каталитической субъединицы, предположительно соответствующие структурным доменам TERT: фрагменты РНК-связывающего домена, каталитического домена, C-концевого домена, а также фрагменты последовательности TERT без N-концевого домена, соответствующие TERT T. castaneum [1]. Далее были созданы генно-инженерные конструкции для экспрессии выбранных доменов в клетках E. coli на основе системы pET30aTEV. Для всех конструкций была тестирована экспрессия рекомбинантного белка. Четыре белка экспрессировались в растворимой форме. Из них три белка (два фрагмента без N-домена, а также фрагмент, соответствующий каталитическому домену TERT) были выделены, очищены и охарактеризованы физико-химическими методами. Показано, что они стабильны в растворе и являются перспективными объектами для структурных исследований.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ-EMBL №12-04-92429-ЕМБЛ_а.

Литература

1.  Gillis AJ, Schuller AP, Skordalakes E. (2008) Structure of the Tribolium castaneum telomerase catalytic subunit TERT. Nature, 455(7213):633-7.

2.  Jacobs SA, Podell ER, Cech TR. (2006) Crystal structure of the essential N-terminal domain of telomerase reverse transcriptase. Nat Struct Mol Biol., 13(3):218-25.

3.  Rouda S, Skordalakes E. (2007) Structure of the RNA-binding domain of telomerase: implications for RNA recognition and binding. Structure, 15(11):1403-12.