Министерство здравоохранения Российской Федерации
Федеральный центр государственного санитарно-
эпидемиологического надзора
Лабораторный Совет госсанэпидслужбы России
Методические рекомендации
по использованию прозрачных аналитических
трековых мембран для санитарно-паразитологических
исследований воды
Москва 2003
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ФЕДЕРАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ГОСУДАРСТВЕННОГО САНИТАРНО -
ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОГО НАДЗОРА
ЛАБОРАТОРНЫЙ СОВЕТ ГОССАНЭПИДСЛУЖБЫ РОССИИ
УТВЕРЖДАЮ
Главный врач Федерального центра
госсанэпиднадзора Минздрава России,
Заместитель главного государственного
санитарного врача России
Председатель Лабораторного совета
Госсанэпидслужбы России
____________________
« 26 » июня 2003 г.
Методические рекомендации
по использованию прозрачных аналитических
трековых мембран для санитарно-паразитологических
исследований воды
Разработаны:
Институтом Медицинской паразитологии и тропической медицины им. Московской медицинской Академии им. (д. м.н. , к. м.н. , к. м.н. ), Федеральным центром госсанэпиднадзора Минздрава России ( к. б.н. , ), Институтом кристаллографии РАН (к. х.н. ), ГНЦ РФ «Физиоко-энергетический институт» (к. ф.м. н. , к. х.н. ), Центром госсанэпиднадзора в г. Челябинске (), Центром госсанэпиднадзора в г. Москве (, ), Центром госсанэпиднадзора в Московской области (), РАГС при Президенте РФ (к. т.н. ).
Рассмотрены, одобрены и рекомендованы к утверждению Лабораторным советом госсанэпидслужбы России как методические рекомендации (протокол от 24. 04.2003 г. № 1), в дополнение к утвержденным Минздравом России методическим указаниям: МУК 4.2.964-00 «Санитарно-паразитологическое исследование воды хозяйственного и питьевого использования»; МУ 2.1.4.1184-03 «По внедрению и применению санитарно-эпидемиологических правил и нормативов СанПиН 2.1.4.1116-02 «Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды, расфасованной в емкости. Контроль качества».
I. Общие положения
1.1. Характеристика аналитических трековых мембран.
Аналитическая трековая мембрана (далее по тексту: трековая мембрана) из тонкой прозрачной полиэтилентерефталатной пленки со сквозными порами диаметром от 0,05 до 5 мкм (ТУ 2255-001-20730545-2003, сертификат соответствия № PОСС RU. ИС11.Р00398 на производство трековых мембран, санитарно-эпидемиологическое заключение
№ 77.ФЦ.12.225.П.000116.06.03).
Выпускаются диски мембран диаметром (25; 37; 47; 70; 142 мм.), в соответствии с используемыми в лаборатории фильтровальными приборами.
Скорость фильтрации через трековые мембраны проб питьевой воды объемом 50 литров в среднем на приборе вакуумного фильтрования 40 – 60 мин; на приборе напорного фильтрования 50-70 мин. При этом количество используемых мембран для исследования одной пробы объемом 50 литров будет зависеть от мутности и химического состава воды.
Использование предфильтров из капроновой сетки (с размером ячейки 70—80 мкм) уменьшает вероятность закупорки пор трековой мембраны.
Прозрачность материала мембраны позволяет проводить микроскопию на самой мембране, исключая последующие этапы (отмывку фильтра и многократную обработку осадка) в соответствии с МУК 4.2.964-00 «Санитарно-паразитологическое исследование воды хозяйственного и питьевого использования».
Эффективность задержания и обнаружения паразитарных объектов на поверхности мембраны составляет:
- яиц гельминтов - 96 -100%, при использовании трековых мембран с диаметром пор 3,0 - 3,5 мкм;
- цист лямблий - 94 - 96%, при использовании трековых мембран с диаметром пор 2,5 – 3,0 мкм и цист других простейших меньших размеров (например ооцист криптоспоридий) до 80%, при использовании трековых мембран с диаметром пор 2,0 - 2,5 мкм.
1.2. Область применения трековых мембран при санитарно-паразитологических исследованиях: - вода открытых водоемов, подземных водоисточников, плавательных бассейнов, сточных вод после биологической очистки, питьевой воды централизованной и децентрализованной системы водоснабжения.
При санитарно-паразитологических исследованиях воды используются трековые мембраны диаметром пор от 2,0 до 3,5 мкм.
1.2.1. Использование трековых мембран
1-й вариант: трековые мембраны используют при пробоподготовке воды и выполнении стандартной методики в соответствии с МУК 4.2.964-00.
2-й вариант: отфильтрованный осадок микроскопируют непосредственно на трековой мембране (см. п. 2.1.2.)
II. Метод применения прозрачных аналитических
трековых мембран для санитарно-паразитологических исследований воды
При первичном использовании трековых мембран их микроскопируют до фильтрации, чтобы ознакомиться с формой и расположением пор.
Для фиксации диска трековой мембраны (или его фрагмента) - на поверхность предметного стекла наносят 1-2 капли 50% раствора глицерина. Затем сверху накладывают трековую мембрану или ее фрагмент в виде полоски (размером с предметное стекло) и накрывают покровным стеклом. Микроскопируют при увеличениях: окуляр 7х или 10х; объектив 10х и 40х. На трековой мембране будут хорошо видны сквозные поры в виде круглых образований с ровными краями, без содержимого (напоминают пузырьки).
Дифференцировка пор трековой мембраны с паразитологическими объектами не представляет затруднений, т. к. размеры яиц гельминтов в 10-20 раз, а цист лямблий в 2-4 раза превышают размеры пор. Поры трековых мембран имеют четкие контуры, не имеют внутреннего содержимого и при микроскопии занимают все поля зрения.
2.1. Ход исследования.
2.1.1. Подготовка трековых мембран к фильтрации.
- трековую мембрану (которая находится между бумажными прокладочными дисками, изготовленными из силиконизированной бумаги), извлекают пинцетом из заводской упаковки и помещают на фритту фильтродержателя прибора для фильтрования (диаметр диска трековой мембраны подбирают в зависимости от имеющейся в лаборатории фильтровальной установки), закрепляют крышкой или в корпусе и проводят фильтрование пробы воды в соответствии с инструкцией к прибору *).
- при фильтрации мутной, с видимыми загрязнениями воды необходимо использовать предфильтры (прилагаемые к прибору для фильтрования или к набору аналитических трековых мембран).
2.1.2. Подготовка и микроскопия трековых мембран
- После фильтрования пробы воды, трековую мембрану извлекают пинцетом, помещают в чашку Петри или в эмалированный лоток поверхностью, которая прилегала к фритте.
- Затем, придерживая трековую мембрану за края пинцетом (не задевая поверхности фильтрации во избежание нарушения целостности препарата и потери искомых патогенов), разрезают ее на отдельные полоски, размер которых соответствует стандартному размеру предметного стекла. Диски трековых мембран диаметром 25; 37; 47 мм можно микроскопировать на больших предметных стеклах не разрезая их на части.
- Полоски трековой мембраны, поверхностью, которая прилегала к фритте помещают на предметное стекло, предварительно обработав его 50% раствором глицерина (для этого на поверхность предметного стекла наносят 1-2 капли 50% раствора глицерина и стеклянной палочкой распределяют по всей поверхности). Всю поверхность полоски трековой мембраны накрывают сверху покровными стеклами (24х24 мм). Микроскопируют при увеличениях: окуляр 7х или 10х; объектив 10х, 40х.
- При исследовании на цисты лямблий, на полоску трековой мембраны, которая уже помещена на предметное стекло с глицерином, наносят сверху каплю 1% раствора Люголя (пропись см. в приложении 1) и накрывают покровными стеклами (24х24 мм) всю поверхность полоски. Микроскопируют при увеличениях: окуляр 7х или 10х; объектив 40х.
*) Примечание:
1) при использовании трековых мембран на приборах вакуумного фильтрования (ПВФ-142 и др.) необходимо учитывать, что толщина диска трековой мембраны меньше на ~100 мкм стандартных мембранных фильтров – это может послужить причиной отсутствия вакуума. Для избежания погрешности, перед укладкой диска трековой мембраны на фритту по краю фильтродержателя укладывают (в соответствии с инструкцией) уплотнительные кольца, которые прилагаются к каждой стандартной заводской упаковке трековых мембран.
2) при большом количестве фильтров после фильтрации одной пробы воды, микроскопия которых требует продолжительного времени
В этом случае потребуется сохранить препараты трековых мембран для отдаленной микроскопии либо использовать метод концентрации осадка:
1-й вариант - сохраняют объекты на трековых мембранах для последующей микроскопии (в течение 2 суток после фильтрации) путем подготовки постоянных препаратов на предметных стеклах с глицерином, как описано в п.2.1.2. Хранят препараты до микроскопии в закрытых чашках Петри, в холодильнике при t - +40 С.
Мембраны (или полоски из них) без подготовки постоянных препаратов и применения глицерина, хранению не подлежат.
2-й вариант – концентрируют осадок с трековых мембран. Для этого в небольшое количество (50-100 мл) дистиллированной воды с рН = 9-12 (щелочная рН позволяет эффективнее смыть с поверхности мембраны паразитарные объекты) смывают кисточкой осадок с трековых мембран. И повторно фильтруют этот смыв через новую трековую мембрану с меньшим диаметром пор (например: при фильтрации всей пробы воды использовалась мембрана с диаметром пор 3,5 мкм, концентрированный смыв через мембрану с диаметром пор 3 или 2,5 мкм). Диаметр диска трековой мембраны для фильтрации концентрированного смыва осадка берется 25 см, который вставляют в приспособление для ручной фильтрации (прилагаемое к трековым мембранам) или имеющиеся в лаборатории приборы для вакуумного фильтрования с соответствующим фильтродержателю диаметром диска. Далее готовится препарат и микроскопируется в соответствии с п.2.1.2.
Приложение 1
Прописи приготовления химреактивов.
- 1% р-ра Люголя: 5 мл маточного р-ра Люголя смешать с 20 мл физиологического р-ра, хорошо перемешать (хранить в склянке из темного стекла).
- Маточный раствор Люголя: 10 г иодида калия растворить в 30 мл дистиллированной воды + 5 г кристаллического йода, размешать до полного растворения и долить до 100 мл дистиллированной водой (хранить в склянке из темного стекла).
- Приготовление смеси Никифорова: смешать равные части серного эфира и 960 этилового спирта.
Приложение 2
СХЕМА ВЫПОЛНЕНИЯ МЕТОДИКИ
Фильтровальный прибор
 | |
 |  |
%
глицерин
!
Предметное
|
микроскопия готового препарата трековой мембраны
на предметном стекле под покровным стеклом
(объектив 10х; окуляр 10х, 40х)
 |
А НА ЛИ Т И ЧЕСКА Я ТРЕКОВАЯ МЕМБРАНА (ATM)
Предназначена для проведения санитарно-
паразитологического анализа питьевой води, вод открытых водоемов, плавательных бассейнов, стоков и др. методом мембранной фильтрации в соответствии с МУК 4.2.964-00 «Санитарно-паразитологические исследования воды хозяйственного и питьевого использования» и в соответствии с МР "По использованию прозрачных аналитических трековых мембран для санитарно - паразитологических исследований воды".
