УДК 615.212.7(075.8)
Разработка химико-аналитического метода определения метаболитов эфедрина водного экстракта из побегов эфедры в моче методом ГХ-МС
© 1*+, 1, 2+, 1, 2*, 1, 2*
1. Российский химико-технологический университет им. , Ул. Героев Панфиловцев д.20, г. Москва, 125480. Россия. Тел.: 8-916-572-96-87. Е-mail: *****@***ru *****@***ru
2. НИИ Фармации, ПМГМУ им. Сеченова Ул. Россалимо д.13, г. Москва,125480. Россия. Тел.: 8-916-572-96-87. Е-mail: *****@***ru
Ключевые слова: лекарственное растительное сырье, побеги эфедры, Р. Тыва, биожидкости, ГХ-МС, ТФЭ.
Аннотация
В статье освещаются вопросы изучения метаболитов эфедрина в моче лабораторных животных и разработки методики пробоподготовки биожидкостей с помощью твердо-фазной экстракции, и последующим определением целевых аналитов методом газовой хроматографии с масс-селективным детектированием.
Введение
Изучение продуктов метаболизма препаратов на основе растительного сырья зачастую является трудной задачей из-за достаточно низкой концентрации интересующих и большого количества сопутствующих веществ в растительном сырье и биообъектах. Нами было проведено исследование биожидкостей животных, получавших водное извлечения из побегов эфедры, повсеместно использующихся в Р. Тыва в лечебных целях.
Сырье Эфедры (хвойника) имеет токсикологическое значение [6]. В связи с этим, нами была предпринята попытка разработки методики, позволяющей проводить определение наиболее активных компонентов сырья данного вида в моче лабораторных животных, принимавших водные извлечения на его основе.
Побеги эфедры, как лекарственное растительное сырье, на протяжении 5 тысяч лет применяются в восточной медицине [4], в том числе и в Р. Тыва. Местным населением препараты на основе побегов Эфедры применяются в качестве средства регулирующего сердечно-сосудистую, выделительную системы и при онко-заболеваниях. В современной научной медицине до недавнего времени препараты эфедрина широко назначались при бронхиальной астме, состояниях, сопровождающихся гипотонией, острых респираторных вирусных инфекциях, простуде, отравлении препаратами группы морфина и скополамином [8]. С другой стороны Р. Тыва является одним из самых неблагополучных районов, где распространено использование некоторых видов растений в качестве прекурсоров наркотических веществ. Так, эфедрин и псевдоэфедрин могут служить сырьём для нелегального производства метамфетамина и эфедрона. Из-за высокого содержания этих веществ, трава некоторых видов хвойника может выступать в роли прекурсора для нелегального производства наркотиков, хотя для этих целей она редко используется на практике [5]. В связи с ужесточением законодательных ограничений в области оборота наркотических средств и психотропных веществ от 3 сентября 2004 года, представители рода Хвойник (лат. Ephedra L.) были включены в список растений, содержащих наркотические вещества, которые запрещены для культивирования на территории Российской Федерации.
Из-за низкого уровня социально-экономического развития северных регионов Российской Федерации (на примере р. Тыва) медицинское обеспечение, а также фармакологическая поддержка местного населения оставляет желать лучшего. Зачастую у местного населения нет другого выхода, кроме как пользоваться растительными источниками лекарственных средств. С другой стороны достоверных научных данных об их безопасности и эффективности не так уж много.
С целью пополнения базы данных о видах, воздействии, метаболизме и идентификации в биожидкостях человека препаратов и их метаболитов на основе редких видов лекарственного растительного сырья, а также в перспективе изучение воздействия данных препаратов на организм с целью предотвращения токсикологического отравления, было и проведено данное исследование.
Экспериментальная часть
Для получения биожидкости (мочи), содержащей интересующие метаболиты, белым лабораторным мышам-самцам на протяжении 7 дней интрагастрально вводили свежеприготовленное водное извлечение (1:10) из побегов эфедры. Далее производили забор мочи у этих животных с целью последующего анализа на алкалоиды эфедринового ряда.
Современный химико-токсикологический анализ состоит из двух основных этапов: 1) предварительные методы исследования 2) подтверждающие методы. В качестве предварительного было выбрано экспресс-тестирование с помощью иммунохроматографических тест-полосок, в качестве подтверждающего – газовая хроматография с масс-селективным детектированием.
Предварительное исследование.
Существует множество иммунохроматографических тестов, позволяющих определять наличие производных фенилалкиламина, наиболее известнымИ из которых являются амфетамин, эфедрин, адреналин и др. Мы учли этот факт и для анализа образцов мочи мышей воспользовались экспресс-тестированием с помощью тест-полосок для определения производных фенилалкиламинов. Иммунохроматографическую полоску вертикально помещали в пробу мочи, при этом температуру исследуемого образца держали в пределах 20-25 С. Тест дал положительный результат, что говорит о достаточно высокой чувствительности метода.
Часто интересующие аналиты находятся в моче в связанном с глюкуроновой кислотой или другими эндогенными соединениями состоянии. Для разрыва связей с этими соединениями необходимо проведение гидролиза. Но с учетом того, что эфедрин на 55-95% выводится в неизменном виде [1], гидролиз не требовался.
Выбор картриджа для проведения твердофазной экстракции.
В качестве методики извлечения анализируемых веществ нами была избрана твердофазная экстракция (ТФЭ), как наиболее эффективная по сравнению с традиционными способами извлечения. Например, классическая жидкость-жидкостной экстракция, зачастую не позволяет проводить экстракцию, если анализируемая проба представлена в микроколичествах. На примере модельных смесей мы подобрали наиболее подходящий сорбент для ТФЭ.
В литературе, к сожалению, отсутствует информация по оптимальному подбору картриджей для твердофазной экстракции [3]. Критерием подбора картриджей служило количество экстрагированного анализируемого вещества из водного раствора. Для этого была приготовлена модельная смесь эфедрина гидрохлорида в концентрации предположительно соответствующей таковой в моче. В качестве картриджей применяли: Sep-Pak C-18 (Waters Corp.), Oasis HLB (Waters Corp.), Oasis MCX (Waters Corp.). Подготовку проб с помощью твердофазной экстракции проводили в соответствии с рекомендациями фирм производителей. Приготовленный раствор эфедрина гидрохлорида дериватизировали трифторуксусным ангидридом, полученные производные упаривали досуха и реконструировали в этилацетате для последующего газохроматографического определения.
В качестве образца сравнения был взят раствор анализируемого вещества объемом 20 мкл в метаноле, который не подвергали твердофазной экстракции. Его упаривали досуха, дериватизировали, полученное производное упаривали досуха и реконструировали в этилацетате. Площадь пика образца сравнения была принята за 100%.
Было установлено, что выход анализируемого вещества на картридже Sep-Pak C-18 составил 87.99%, Oasis HLB - 80.06, Oasis MCX -75,66%. Таким образом, был выбран картридж Sep-Pak C-18.
Подготовка картриджа для ТФЭ.
Картридж помещали в вакуумный манифолд для ТФЭ и последовательно промывали 1 мл метанола, 1 мл смеси метанол-вода (1:1) и 1 мл деионизованной воды.
Процесс экстракции.
Образец пропускали через картридж с подготовленным сорбентом со скоростью 2 мл/мин. Далее в течении 10-15 минут через картридж пропускали поток воздуха до полного высушивания сорбента. Далее сорбированные вещества смывали в виалу емкостью 2 мл смесью дихлорметан/2-пропанол (3:1). Затем содержимое виалы упаривали досуха в токе сухого воздуха при 50 єС.
Дериватизация
Следующим этапом была модификация анализируемого вещества с целью улучшения его газохроматографических характеристик. Существует множество дериватизирующих агентов. В соответствии с литературными данными, а также данными из практики, в качестве оптимального нами был выбран метил-бис-трифторацетамид (МБТФА).
К сухому остатку в виале, полученному после твердофазной экстракции и упаривания добавляли 20 мкл МБТФА, герметически закрывали и помещали в термостат, нагретый до 80 єС на 15 минут. После этого смесь упаривали досуха в токе сухого воздуха при 50 єС. Далее сухой остаток реконструировали в 100 мкл этилацетата. Проводили ГХ-МС анализ.
Газовая хроматография с масс-селективным детектированием.
Так же нами были подобраны условия масс-спектрометрического определения эфедрина в моче (сканирование проводилось по полным и выделенным ионам, что обычно позволяет вести детектирование анализируемых веществ в малых концентрациях). На примере одной из полученных хроматограмм хорошо виден пик анализируемого вещества – производного эфедрина. По сравнению со временем удерживания, масс-спектру образца сравнения, а также библиотечному масс-спектру PMW-Tox, он полностью соответствует масс-спектру производного эфедрина (Рис. 1).
Инструментальный анализ проводили на газовом хроматографе Agilent 6890.
Параметры метода масс-спектрометрического детектирования: колонка НР-5MS, 0,25 мм, 0,25 мкм; газ-носитель гелий марки А; температура инжектора 250 °С; термостат: начальная температура 70 °С – 2 мин, повышение температуры со скоростью 20 °С/мин до 280 °С, сохранение такой температуры 15 мин; инжектор Splitless; скорость потока газа-носителя 1 мл/мин. «Задержка на растворитель» - время включения катодов и анализатора - через 3 мин после ввода пробы. Диапазон сканируемых масс 50-700 а. е.м. Температура источника ионов 230 °С. Температура анализатора 150 °С. Режим работы детектора устанавливается по стандартной программе «AUTOTUNE».
Детектирование при сканировании по полному ионному току производили при сравнении масс-спектра пика вещества с масс-спектром из библиотек масс-спектров PMW-Tox.
Рис. 1 Хроматограмма экстракта мочи, содержащего эфедрин 2-ТФА
Выводы: таким образом, была разработана новая универсальная методика определения метаболитов эфедрина в микроколичествах в моче с помощью твердофазной экстракции и последующим детектированием на ГХ-МС.
Благодарности: выражаем благодарности , заведующей лабораторией биологически активных соединений НИИ молекулярной медицины ПМГМУ им. Сеченова, за предоставление возможности работы с лабораторными животными и получения материалов для исследования.
Литература
[1] , ., , . Современные подходы к анализу наркотических веществ в биологических объектах//Судебно-медицинская экспертиза. – 2007. – с. 28-32
[2] Popat N. Patil, A. Tye and J. B. LaPidus A pharmacological study of the ephedrine isomers JPET May 1965 vol. 148, no. 2, pp. 158-168.
[3] J. Krol, “The Ephedra Story: Analysis of Ephedra Alkaloids Using LC/UV, Part 2: The Sample Preparation Validation,” Waters Corp. (Milford, MA, 2002).
[4] Ikhlas A. Khan, Ehab A. Abourashed. Ephedra // Leung's Encyclopedia of Common Natural Ingredients: Used in Food, Drugs and Cosmetics. — 3rd. — New York: Wiley, 2009
[5] Andrews K. M. (1995). «Ephedra's role as the precursor in the clandestine manufacture of methamphetamine». Journal of Forensic Science 40: 551—560.
[6] Гусынин ядовитых растений. — М.: Изд. сельскохозяйственной литературы, журналов и плакатов, 1962.
[7] Постановление Правительства Российской Федерации от 3 сентября 2004 г. № 000. М.: Федеральная служба Российской Федерации по контролю за оборотом наркотиков (3 сентября 2004).
[8] WHO Monographs on Selected Medicinal Plants. — Volume 1: Herba Ephedrae. — Geneva: World Health Organization, 1999. — P. 145—153.
Analytical method development of ephedrine metabolites detection in urine by GC-MS
Barsukova Daria, Kovalenko Alexey, Kardonsky Dmitry, Eganov Alexander
1. Analitycal chemistry department. Russian Mendeleyev University of Chemical Technology. Russia. Moscow, Geroev Panfilovcev st, 20. 125480. ph.: 8-916-572-96-87. Е-mail: *****@********@***ru
2. Analytical laboratory NII Pharmacy, PMGMY of Setchenov. Russia. Moscow, Rossalimo st, 13, 125480. ph.: 8-916-572-96-87. Е-mail: *****@***ru
Key words: medicinal raw plant, Ephedra’s stems, Tyva republic, bioliqiuds, SPE, GC-MS
Annotation
This article deal with the questions of studying metabolites’ of ephedrine in urine and bioliquids sample preparation technique, using solid-phase extraction, and the subsequent detection of target analytes by GC-MS.
