Лекция 13. ГЕНЕТИческий анализ у прокариот
1. Особенности микроорганизмов как объекта генетических исследований.
2. Трансформация бактерий.
3. Трансдукция у бактерий.
4. Конъюгация у бактерий.
1. Особенности микроорганизмов как объекта генетических исследований
Микроорганизмы имеют общие особенности, которые сделали их основным объектом молекулярной генетики.
Основной их особенностью является короткий жизненный цикл. Например, многие бактериофаги, вирусы и бактерии заканчивают жизненны цикл в течение 20-30 минут. Эта их особенность обеспечивает возможность получения огромного числа поколений в короткие сроки.
Другая особенность микроорганизмов - большая скорость размножения - обеспечивает получение огромного количества особей одновременно, что дает возможность обнаруживать такие генетические явления, которые встречаются с частотой один на миллион и реже.
Третья особенность - наличие у многих микроорганизмов двух способов размножения (бесполого и полового). Это создает возможность получения рекомбинаций в ходе полового размножения и изучения продуктов рекомбинации непосредственно после мейоза в гаплофазе при бесполом размножении.
Все эти особенности увеличивают разрешающую способность генетического анализа.
Кроме того, микроорганизмы легко выращивать в строго контролируемых условиях, используя жидкие или твердые среды определенного состава, регулируя температуру и т. д.
Изучение генетики микроорганизмов проводится по признакам клонов, штаммов, колоний.
Признаки делятся на несколько групп. Морфологические признаки связаны с формой или размерами колоний, характером ее поверхности и т. д. Оцениваются они, как правило, визуально, но и при помощи компьютерного сканирования.
Биохимические признаки связаны с изменением в синтезе тех или иных веществ. Они изучаются у микроорганизмов благодаря использованию метода селективных сред. Сущность этого метода состоит в следующем: организмы дикого типа - прототрофы - способны жить и размножаться на среде, содержащей минеральные соли и углеводы, из которых они синтезируют все необходимые для своей жизни вещества. Такая среда называется минимальной.
В отличие от прототрофов ауксотрофы - организмы, утерявшие способность к синтезу тех или иных веществ. Они не способны жить на минимальной среде. А могут расти на полной среде, т. е. среде содержащей все необходимые для жизни метаболиты.
Для того чтобы точно определить, какая именно биохимическая мутация характеризует тот или иной клон ауксотрофов, необходимо использовать селективную среду, т. е. среду, которая отличается от полной отсутствием того или иного метаболита (витамина, аминокислоты), а оптимальной - наличием этого вещества. Например, если анализируемый клон живет на селективной среде, представляющей собой минимальную среду с добавкой только аминокислот, это значит, что он является ауксотрофом по аминокислотам, т. е. он не способен синтезировать какую-то аминокислоту. Какую именно - легко определить, используя селективные среды с содержанием отдельных аминокислот.
Частота возникновения ауксотрофов невелика, поэтому для ускорения работы используют дополнительно метод отпечатков.
Для облегчения пересева колоний применяют специальную бархатную печатку, имеющую размер и форму чашки Петри. Сначала к печатке прикладывают чашку с анализируемыми колониями, выросшими на плотной среде. На ворсинках бархата остаются клетки отдельных колоний. Затем к этой печатке прикладывают две чашки - с минимальной и полной средой. После инкубации таких отпечатков сопоставляют колонии, выросшие на полной и на минимальной среде. Практически это делают следующим образом: чашку с минимальной средой ставят на чашку с полной средой так, чтобы идентичные колонии совпали. Просматривая две совмещенные чашки, на чашке с полной средой отмечают колонии, которые не выросли на минимальной среде. Это дает возможность обнаружить мутантные колонии.
Существуют также специальные методы концентрирования биохимических мутантов. Сущность одного из них заключается в том, что к суспензии клеток в жидкой минимальной среде добавляют антибиотик пенициллин. Установлено, что пенициллин поражает только делящиеся клетки. Так как в минимальной среде размножаются клетки только дикого типа, то они в основном и поражаются. Не размножающиеся на минимальной среде биохимические мутанты не поражаются. Затем клетки отмывают от пенициллина и высеивают на полную среду в чашки Петри. Так как большая часть клеток дикого типа была убита пенициллином, то среди вырастающих колоний на полной среде относительное количество колоний биохимических мутантов оказывается увеличенным.
2. Трансформация бактерий
Изучение бактерий открыло новые источники наследственной изменчивости и механизмы наследственной передачи. Одним из первых успехов в этой области было открытие явления трансформации у бактерий в 1928г.
Известно несколько штаммов пневмококка Diplococcus pneumoniae: штамм S - с полисахаридной капсулой и гладкими колониями и штамм R - без капсулы и с шероховатыми колониями. Оба эти признака наследственны. риффитс инъецировал мышам вместе с убитым нагреванием штаммом пневмококка, обладающим капсулой (S), штамм живого пневмококка, лишенного капсулы (R).
Спустя некоторое время ему удалось выделить из зараженных мышей живых пневмококков, обладающих капсулой. Таким образом, оказалось, что свойство убитого пневмококка - способность образовывать капсулу - перешло к живой бактерии. Поскольку признак наличия капсулы является наследственным, то следовало предположить, что какая-то часть наследственного вещества от бактерий штамма S перешла к клеткам штамма R. Можно было предполагать, что в этом случае либо возникла мутация, либо произошла своеобразная гибридизация между живыми и мертвыми бактериями. Первое объяснение было наиболее вероятным, однако второе оказалось ближе к истине.
В 1944г. О. Эвери с сотрудниками выяснили природу этого явления. Они взяли те же два штамма - R и S. Перед началом решающих опытов было изучено спонтанное мутирование обеих форм. Оказалось, что гладкая S - форма хотя и очень редко, но спонтанно мутирует в R - форму, а R - форма практически не мутирует в S - форму, т. е. мутации происходят в одном направлении: S→R. Но если R - форму помещали в экстракт из убитых клеток S - формы, то частота изменений R→S увеличилась в 10 000 раз. Признак одного штамма (S) через какое-то вещество экстракта передавался другому штамму (R), т. е. возникло направленное наследственное изменение.
Далее была произведена тщательная очистка - выделение этого вещества из экстракта клеток S - формы. Вещество было названо трансформирующим фактором (ТФ), а само явление - трансформацией.
Трансформирующий фактор по своей биохимической природе представлял собой не что иное, как ДНК, входящую в состав хромосом. При этом было установлено, что он обладает некоторыми характерными свойствами. Его можно экстрагировать из клеток, очищать, воздействовать на него химическими и физическими факторами и затем снова вводить в живые клетки и изучать вызываемые им изменения.
Явление трансформации стало одним из основных доказательств роли ДНК как носителя наследственной информации. Теперь термином «трансформация» обозначают особый способ гибридизации бактерий, при котором происходит включение ДНК из клетки одного генотипа в клетку другого генотипа, приводящий к рекомбинации генов.
После открытия явления трансформации у бактерий были сделаны попытки обнаружить это явление у высших животных. Получив экстракты ДНК из определенных частей организма одного генотипа, их вводили другому в надежде на то, что специфическая ДНК донора вызовет в ДНК половых клеток реципиента направленное изменение. Однако убедительных результатов трансформации у высших организмов не было получено.
Хотя, в принципе осуществление трансформации на соматических клетках животных и человека вполне возможно. Уже известно, что клетки в культуре ткани могут усваивать, включать меченую ДНК из среды.
3. Трансдукция у бактерий
Изучение явления трансформации послужило толчком к открытию другого явления - трансдукции - переноса и рекомбинации генов у бактерий с помощью бактериофага. Опыт, позволивший открыть этот новый генетический механизм и новый способ изучения наследственности, заключается в следующем: U - образная трубка в нижней части была разделена бактериальным фильтром. В одну половину этой трубки были помещены тифозные бактерии (Salmonella typhimurium) штамма 22А, а в другую половину трубки - штамма 2А. При этом бактериальные клетки не могли переходить сквозь перегородку.
Штамм 22А нес мутацию, блокирующую синтез триптофана Т-, и поэтому при культивировании бактерии нуждались в добавке триптофана в среду. Штамм бактерии 2А имел мутацию, блокирующую синтез гистидина Н-, и поэтому нуждался в нем при культивировании.
После инкубации этих двух разных штаммов в трубке, разделенной только бактериальным фильтром, был произведен рассев клеток обоих штаммов. При рассеве клеток штамма 22А на среде, лишенной триптофана, было обнаружено небольшое число колоний.
Следовательно, некоторые клетки штамма 22А каким-то образом приобрели способность синтезировать триптофан и смогли дать колонии на среде без этой аминокислоты. Частота появления таких клеток была равна 1х10-5.
Можно было предположить, что эти измененные клетки появились или в результате обратной мутации от Т - в Т+ или перехода трансформирующего фактора от штамма 2А. Но штамм 22А отличался высокой стабильностью, и поэтому указанную частоту появления (10-5) клеток генотипа Т+ нельзя было объяснить возникновением обратных мутаций. Трансформирующий фактор в среде также не был обнаружен. Фильтрующимся агентом, переносящим ген Т+ от штамма 2А к штамму 22А, оказался бактериофаг. Это открытие сделал в 1952г. Н. Циндер и Дж. Ледерберг.
Используемый в исследованиях Циндера и Ледерберга штамм 22А не обладал способностью синтезировать триптофан, но после совместного содержания в разделенной фильтром U - образной трубке со штаммом 2А приобрел свойство синтезировать триптофан. Это могло произойти только в том случае, если фаг, вышедший из клеток штамма 2А, проник через фильтр, внедрился в некоторые клетки штамма 22А и передал им часть наследственной информации - фрагмент наследственного материала штамма 2А.
Следовательно, ДНК фага, каким-то образом претерпевает рекомбинацию с ДНК бактериальной клетки, в силу чего в новые фаговые частицы включаются гены клетки-хозяина. Эти фаги, заражая вновь клетки другого генотипа, также передают ей свою ДНК с новой информацией. Так клетки штамма 22А приобрели ген, ответственный за синтез триптофана.
Фаг может переносить самые различные гены бактерий, обуславливающие определенный характер синтеза аминокислот, различные ферментативные свойства, устойчивость к антибиотикам и иммунность к другому фагу. Как правило, одновременно трансдуцируется один, реже - два тесно сцепленных гена и очень редко три гена.
Таким образом, трансдукция так же, как и трансформация, является своеобразным процессом рекомбинации генов. Рекомбинация генов является одним из механизмов, осуществляющих у бактерий комбинативную изменчивость, которая у высших организмов обеспечивается мейозом.
4. Конъюгация у бактерий
С помощью трансформации и трансдукции осуществляется односторонний обмен наследственными факторами между бактериями. И эти процессы в какой-то мере компенсируют отсутствие у них настоящего полового процесса.
Поиски полового процесса у бактерий в течение длительного времени были безуспешными. Лишь после того, как были разработаны методы селективных сред и получены штаммы биохимических мутантов, Дж. Ледерберг и Е. Татум в 1946г. доказали наличие своеобразного полового процесса у Escherichia coli на примере штамма К12. Процесс переноса генетической информации от одной бактерии к другой при контакте клеток получил название конъюгации.
Вначале доказательство наличия полового процесса у бактерий основывалось на генетическом методе получения рекомбинантов. У E. coli был получен ряд биохимических мутантов с различными потребностями в биотине (В-), метионине (М-), пролине (Р-), треонине (Т-). Все штаммы бактерий с этими мутациями не росли на минимальной среде.
Чтобы проверить возможность образования рекомбинантов, были взяты два штамма различающиеся по генотипу: В - М - Р+ Т+, и В+ М+ Р - Т-, и по фенотипу - потребностях в аминокислотах и витамине. Первый для своего роста нуждался в биотине и метионине, но не нуждался в пролине и треонине. Второй штамм нуждался в двух последних веществах и не нуждался в двух первых.
Клетки обоих ауксотрофных штаммов в течение некоторого времени выращивали в смешанной культуре, а затем высевали на минимальную среду. Ни один из исходных штаммов не смог расти на этой среде.
