Конференция «Современные методы флуоресцентного молекулярного имиджинга (ADFLIM)» Сочи, Россия 3–6 октября 2016 (стр. 3 )

15 мин        1, 1, 2, 1  1ФИЦ «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН, Москва, Россия; 2Becker & Hickl GmbH, Берлин, Германия

FLIM-FRET генетически-кодируемого сенсора каспазы 3 в опухолевых ксенографтах

15 мин        ,   Московский государственный университет им. , Химический факультет, Москва, Россия

Система биолюминесцентного резонансного переноса энергии на основе люциферазы светляков L. mingrelica и ее применение в гомогенном иммуноанализе

11.30 –12.00        Кофе-брейк

пленарные лекции

СОВРЕМЕННАЯ ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ МИКРОСКОПИЯ

Председатели Karsten Koenig, Ago Rinken

Зал «Рубин»        6 октября, 16.15 – 17.10

20 мин        Aisada Uchugonova  Saarland University, Saarbruecken, Germany

Фемтосекундная лазерная микроскопия стволовых клеток

20 мин        1, 1, 2, 1,3, 1,3, 1,3, 1, А. Родик4, М. Джорджевич4, 1, 1–3  1Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого, Санкт-Петербург, Россия; 2Ваксманский институт микробиологии, Ратгерс, США, Университет Нью-Джерси, США; 3Сколковский институт науки и технологии, Сколково, Россия; 4Факультет биологии, Университет Белграда, Белград, Сербия

Исследование системы рестрикции-модификации Esp1396I в E. coli на уровне одиночных клеток с использованием флуоресцентной микроскопии

15 мин        1, 2–5, 1, 1, 2–5, 6, Г. Бюльдт1,7, Т. Генш8, 1,2  1Московский физико-технологический институт, Лаборатория перспективных исследований мембранных белков, Долгопрудный, Россия; 2ICS-6: Структурная биохимия, Институт комплексных систем (ICS), Исследовательский центр г. Юлих, Германия; 3Университет Гренобля Alpes, Франция, Институт структурной биологии, Гренобль, Франция; 4CNRS, Институт структурной биологии, Гренобль, Франция, 5CEA, Институт структурной биологии, Гренобль, Франция; 6Институт Бридж, Факультет химии, физики и астрономии, Университет Южной Калифорнии, Лос Анджелес, Калифорния, США; 7ICS-5: Молекулярная биофизика, Институт комплексных систем (ICS), Исследовательский центр г. Юлих, Германия; 8ICS-4: Клеточная биофизика, Институт комплексных систем (ICS), Исследовательский центр г. Юлих, Германия

Изучение in meso кристаллизации мембранных белков методами флуоресцентной микроскопииЗакрытие конференции ADFLIM

Зал «Рубин»        6 октября, 17.10 – 17.30

Учредительная конфернция
Российского общества молекулярного имиджинга

Зал «Рубин»        6 октября, 17.30

Визуализация биологических объектов в c-CARS микроскопии

А. Айбуш, Ф. Гостев, А. Титов, В. Надточенко

Институт химической физики им. РАН, Москва, Россия

В последние годы наблюдается большой интерес к получению химически селективных изображений сложных биологических объектов. Широко используются методы, основанные на многофотонной флюоресцентой и рамановской микроскопии. Несмотря на то, что КАРС микроскопия обладает целым рядом достоинств, подобные системы довольно сложны в реализации и в большинстве случаев используют пикосекундные лазерные импульсы. Между тем, сочетание пикосекундных и фемтосекундных импульсов может дать дополнительные возможности, которые основаны на спектральных свойствах лазерных импульсов фемтосекундного диапазона. В этой работе мы изучили двухимпульсную модификацию КАРС (т. н. чирпированный КАРС, c-CARS), а также возможное применение схемы для биологических объектов. Фемтосекундный импульс накачки в нашей c-CARS схеме растягивался до 10–15 пс, в то время как стоксов фемтосекундный импульс мог сканировать частоты импульса накачки при изменении задержки между импульсами. Подобное сканирование частот позволяет реконструировать ИК спектр гораздо быстрее, чем в обычной КАРС микроскопии, что может быть использовано для трехмерных сканирующих систем где быстродействие является важным параметром. Более того, в данной методике возможно быстро покрыть частотный диапазон от “fingerprints” до ~4000 1/см благодаря быстрой перестройке импульса накачки. Для некоторых простых образцов мы исследовали спектральное разрешение системы, а также способы разделения резонансного и нерезонансного сигналов вещества. В работе также продемонстрированы КАРС сканы некоторых биологических объектов: растительной клетки и среза эмбриона мыши. Работа поддержана грантом РНФ 14-14-00856.

Флуоресцентное определение изменений уровня пероксида водорода при воздействии цисплатина на опухолевые клетки

, ,

ФИЦ Институт прикладной физики РАН, Нижний Новгород, Россия

В нашем исследовании была использована линия клеток HeLa Kyoto, трансФИЦ ированная внутриклеточным сенсором HyPer2 [1], чувствительным к изменениям в уровне пероксида водорода и нечувствительным к изменениям уровней других активных форм кислорода, и контрольная линия клеток, трансФИЦ ированная внутриклеточным нечувствительным к изменениям пероксида водорода сенсором. Клетки обрабатывали противоопухолевым препаратом «цисплатин». Воздействие препаратом производилось в разных дозах и с различной длительностью. Для оценки уровня перекиси водорода при воздействии химиотерапии использовался метод проточной цитометрии одновременно с маркером на апоптоз PE Annexin V и витальным красителем 7-AAD. После экспозиции с препаратом отдельно рассчитывалось количество жизнеспособных клеток, клеток в стадии раннего апоптоза и клеток в позднем апоптозе/некротических клеток. Ответ флуоресцентного сенсора на цитотоксическое воздействие определяли для каждой клеточной популяции [2]. Возрастающие концентрации препарата вызывали постепенное уменьшение количества жизнеспособных клеток и, соответственно, увеличение числа клеток в стадиях раннего апоптоза, позднего апоптоза и некроза в обеих клеточных линиях HeLa Kyoto по сравнению с контролем. Были продемонстрированы дозо-временная зависимость в повышении уровня пероксида водорода раковых клеток при воздействии цисплатина. Принимая во внимание, что реакция сенсора HyPer2 наблюдалась в популяции жизнеспособных, не апоптотических клеток, обнаруженные изменения уровня пероксида водорода не являются следствием клеточной гибели.

Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 16-34-01112 мол_a.

1. K. N. Markvicheva, D. S. Bilan, N. M. Mishina, A. Yu. Gorokhovatsky, L. M. Vinokurov, S. Lukyanov, V. V. Belousov, “A genetically encoded sensor for H2O2 with expanded dynamic range”, Bioorganic & Medicinal Chemistry 19, 1079-1084 (2011).

2. A. S. Belova, А. G. Orlova, I. V. Balalaeva, N. O. Antonova, N. М. Mishina, E. V. Zagaynova. “Hydrogen peroxide detection in viable and apoptotic tumor cells under action of cisplatin and bleomycin”, Photon Laser Med, 1-9 (2016).

Изучение in meso кристаллизации мембранных белков методами флуоресцентной микроскопии

1, 2,3,4,5, 1, 1, 2,3,4,5, 6, Г. Бюльдт1,7, Т. Генш8, 1,2

1Московский физико-технологический институт, Лаборатория перспективных исследований мембранных белков, Долгопрудный, Россия; 2ICS-6: Структурная биохимия, Институт комплексных систем (ICS), Исследовательский центр г. Юлих, Германия; 3Университет Гренобля Alpes, Франция, Институт структурной биологии, Гренобль, Франция; 4CNRS, Институт структурной биологии, Гренобль, Франция, 5CEA, Институт структурной биологии, Гренобль, Франция; 6Институт Бридж, Факультет химии, физики и астрономии, Университет Южной Калифорнии, Лос Анджелес, Калифорния, США; 7ICS-5: Молекулярная биофизика, Институт комплексных систем (ICS), Исследовательский центр г. Юлих, Германия; 8ICS-4: Клеточная биофизика, Институт комплексных систем (ICS), Исследовательский центр г. Юлих, Германия

Появление кристаллизации in meso 30 лет назад начало новую эру структурных исследований мембранных белков. С тех пор этот метод связан с такими прорывами, как структурные исследования бактериальных родопсинов и связанных с G-белком рецепторов. В данной работе использовалась флуоресцентная микроскопия для изучения in meso кристаллизации бактериородопсина. Нативная флуоресценция бактериородопсина позволяет наблюдать за кристаллизацией немодицированного белка, а кристаллизация в in meso фазе предоставляет стабильную среду для продолжительных наблюдений. Нативная флуоресценция и генерация второй гармоники (SHG) в кристаллах дает возможность получить новую информацию о процессе in meso кристаллизации. Кристаллизация начинается с образования микрокристаллов, за которым следует рост нескольких кристаллов за счет окружающих их микрокристаллов с образованием обедненной белком зоны вокруг растущего кристалла. Эти наблюдения указывают на механизм созревания Оствальда при in meso кристаллизации бактериородопсина. Образование обедненной зоны вокруг растущего кристалла согласуется с ранее предложенной аналогией между ростом кристалла в in meso фазе и в условиях микрогравитации при отсутствии конвекции. Работа поддержана грантом РНФ 14-14-00995.

Изучение эндогенной флуоресценции живых клеток млекопитающих методом FLIM

1, 1, 1,2

1ФИЦ  «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН; 2Московский государственный университет им. , Москва, Россия

Эндогенная флуоресценция в ходе своей трансформации может служить одним из показателей изменения биохимического статуса клеток, что на сегодняшний день продемонстрировано для целого ряда эндогенных флуорофоров. Поэтому изучение автофлуоресценции клеток является важной научной задачей, как для фундаментальных, так и для прикладных биологических исследований. В настоящей работе получено распределение флуоресцентного сигнала в опухолевых клетках методом FLIM при возбуждении в диапазоне возбуждения флавинов и с помощью флуоресцентной микроскопии с использованием сигнала митохондриальной локализации Mitotracker Orange. Выполнен анализ и сопоставление результатов, полученных обоими методами. Флуоресцентный сигнал детектировали на конфокальном флуоресцентном микроскопе с временным разрешением MicroTime 200 (PicoQuant GmbH, Германия). Обработку изображений производили с использованием программного обеспечения PicoHarp и SymPhoTime (PicoQuant GmbH, Германия). Для возбуждения клеток (HELA) использовали твердотельные лазеры с длинами волн возбуждения 405 нм, 473 нм, 532 нм (PicoQuant GmbH, Germany), а для детекции флуоресценции – фильтры 548/10 нм, 580 нм, 605/15 нм (Semrock, США). Спектры флуоресценции из участков кадра получали с использованием камеры Andor (PicoQuant GmbH, Германия). В ходе исследований установлены особенности распределения флуоресцентного сигнала в опухолевых клетках при возбуждении в диапазоне длин волн 405–532 нм. Доказано, что при данных условиях источником флуоресцентного сигнала являются органеллоподобные структуры в цитоплазме, которые определяются как митохондрии при специфическом окрашивании. Также, наблюдалось яркое неконтрастное свечение в месте контактирования клеток и свечение органеллоподобных структур по периферии бесконтактных клеток. Результаты работы могут найти применение при переходе от in vitro исследований на клетках к in vivo исследованиям на животных, когда изменение уровня эндогенных флуорофоров может являться показателем развития ряда патологических процессов. Работа выполнена при поддержке гранта РНФ №15-14-30019 от 8.07.2015.