Детектирование хиральных биомолекул методами, применимыми при исследовании планет in situ (стр. 2 )

Предварительные исследования.

       В 1996-1998 лаборатория, руководимая , осуществила серию экспериментов по исследованию эффектов хиральности в тартратах.  Эти исследования проводились в рамках проекта CRDF (грант RC1-204).  Было обнаружено, что хиральный состав кластеров (димеров и тримеров) определяет их стабильность в газовой фазе.  Наиболее стабильными оказались гомохиральные димеры RRH+ и SSH+, а также тримеры RRRBH+  и SSSBH+ (содержащие только лиганды одного типа хиральности).  Было высказано предположение, что центральный ион  BH+ в таких комплексах (например, R-NH3+, NH4+, H3O, или щелочной ион A+)  образует вместе с тримером пропеллерную структуру тригональной симметрии (, 1997).  Также была обнаружена необычайно высокая дискриминация по хиральности в гомохиральных комплексах по отношению к гетерохиральным соединениям RRSBH+ и RSSBH+, имеющим в своем составе лиганды различной хиральности.  Обнаруженная в этих экспериментах дискриминация по хиральности достигает соотношения 40:1 для тримеров и 10:1 для димеров.  Также были проведены квантово-химические расчеты для объяснения обнаруженного эффекта. Однако, аналогичные эксперименты, проведенные в группах Николаева и Футрелла, показали  значительно более слабое влияние хиральности на устойчивость димеров, связанных водородной связью. Этот факт был объяснен исходя из предположения, что координация вокруг протона происходит таким образом, что  никакие внутримолекулярные водородные связи не образуются, а это приводит, в свою очередь, к меньшим различиям в устойчивости  гомо и гетеро димеров. Сильное влияние  типа центрального комплексообразующего иона на  различие в устойчивости гомо и гетеро димеров для тартратов позволяет надеяться на то, что  при выборе подходящего центрального иона  могут быть обнаружены  хиральные эффекты для ассоциатов аминокислот. Группа Кукса наблюдала значительные  различия в хиральности при образовании кластерных ионов аминокислот при использовании тандемной масс - спектрометрии ( Буш и сотр. 1988) и мягкой диссоциации  выбранного кластерного иона с  двухвалентной медью в качестве центрального иона. При этом не только  достигается хиральное распознавание, но  может  также  быть проведен количественный анализ смесей энантиомеров. Кинетический метод, предложенный и развитый в этой группе и широко применяемый  для измерения термохимических величин, обеспечивает чувствительный подход  к обнаружению очень малых различий в устойчивости образующихся ионов, тогда как  комплексы с двухвалентной медью в качестве центрального иона обеспечивают  осуществление многоконтактных взаимодействий, необходимых для проведения хирального распознавания.  Однозарядные  кластерные ионы на двухвалентной меди [CuII (a. a.)(ref*)2-H]+ (a. a.=аминокислоты, ref*=реперный хиральный лиганд, выбранный из природных аминокислот)  в результате процесса столкновительной диссоциации в квадрупольной ионной ловушке диссоциируют на  ионы [CuII(a. a.)(ref*)-H]+  и [CuII(ref*)2-H]+. Относительное распределение интенсивностей  диастереомерных ионов, полученных при диссоциации иона[CuII(a. a.)(ref*)2-H]+ сильно зависит от стереохимии лигандов в комплексных ионах. При тщательном выборе репера все 19 природных хиральных аминокислот, кроме цистеина и аргинина, высоко разрешаются. В отличие от более ранних экспериментов на тартратах введение изотопной метки не требуется, а чувствительность, точность  и универсальность этого метода представляются многообещающими.

  Предлагаемая методика хирального распознавания аминокислот методом масс-спектрометрии

  Достаточно просто использовать описанные выше явления для хирального распознавания аминокислот. К смеси энантиомеров неизвестного состава добавляется  известное количество  изотопно-меченой смеси хиральных молекул с известным соотношением энантиомеров  (соответствующие энантиомеры должны быть помечены по-разному). Измеряются распределения интенсивностей пиков димеров в масс-спектре, и различия в распределении интенсивностей для димеров, образующихся из немеченых анализируемых веществ и из лево - или право - вращающих(меченых) контрольных молекул  дают нам соотношение концентраций энантиомеров в анализируемой смеси.

  Кинетический метод с помощью ионов переходных металлов  обеспечивает альтернативный подход, в котором не используется изотопная метка образцов. В этом случае хиральное различие определяется при сравнении относительных интенсивностей пиков диастереомерных комплексных ионов и  реперного иона в тандемном масс-спектре соответствующих кластерных ионов. В этом методе могут быть проанализированы смеси энантиомеров, и энантиомерный состав в этом случае определяется из соотношения относительных интенсивностей линий.

  Эти методы могут быть использованы для анализа любого типа хиральных молекул, у которых хиральность влияет на устойчивость димеров или тримеров. 

Чувствительная природа предлагаемых методов позволяет анализировать смеси на энантиомерную чистоту с высокой степенью точности. Соответственно, настоящая методология может быть предложена в качестве практически полезного метода хирального анализа важных биологических молекул, таких как аминокислоты и пептиды. Она также может служить основой для создания  метода  молекулярного распознавания в газовой фазе. Предлагаемые методы могут быть использованы при низких температурах, которые  фактически даже способствуют протеканию процессов ассоциации (Randeniya  et al.,1989). Для анализа необходимы только микроколичества хиральных веществ. Для использования предлагаемых методов в хиральном анализе аминокислот необходимо найти такие хиральные соединения, которые могут образовывать ионно-молекулярные ассоциаты с молекулами  аминокислот и  при этом должны существовать заметные различия в устойчивостях гомо - и гетерохиральных димеров или тримеров.

  Основной частью данного проекта является поиск таких веществ в различных классах хиральных соединений. В частности, мы ищем классы хиральных образцов, которые действуют в качестве распознающих хиральность объектов для широкого диапазона хиральных биологических молекул, а также образцов с высокой селективностью к определенным хиральным образцам (таким как D-аланин).

       Значительный прогресс был достигнут группой Кукса (Тао и др.), которая наблюдала сильное хиральное распознавание, когда реперный лиганд имел ароматическую цепь.  Мы распространим наши исследования на такие хиральные  объекты как тартраты и краунэфиры. Ионы других переходных металлов, таких как никель, железо, цинк, кобальт и палладий, которые являются превосходными хелатообразующими ионами, будут проверены в качестве центров для димерных и тримерных кластеров.

       В настоящее время для создания ионных комплексов из хиральных молекул используется несколько различных ионизационных методов: химическая ионизация, бомбардировка быстрыми атомами, атмосферная ионизация, электрораспыление в вакуум, лазерная десорбция, лазерная десорбция из матрицы и др. Не все из них применимы для астробиологических исследований. Группа Николаева использует химическую ионизацию, лазерную десорбцию и электрораспыление в вакуум в своих исследованиях, в то время как группа Кукса использует электрораспыление в вакуум для создания хиральных комплексов в газовой фазе. Использование электрораспыления в вакуум в планетарных исследованиях затруднено тем, что в этом методе используется жидкость; тем не менее, этот метод может быть использован в результате миниатюризации источников для электрораспыления в вакуум и использованием нанокапилляров с достаточно малыми количествами вещества, которые могут нагреваться источниками низкой мощности. Более приемлемым методом является атмосферная ионизация, которая основана на использовании коронного разряда низкой мощности. Одной из основных целей проекта является доказательство возможности распознавания хиральности в аминокислотах методами электрораспыления в вакуум и атмосферной ионизации в условиях соответствующих требованиям орбитального масс-спектрометра.

       Выбор типа масс-спектрометра для модельных экспериментов по распознаванию хиральности.

       Для использования описанного выше метода распознавания хиральности в астробиологических экспериментах, масс-спектрометр должен иметь низкую массу, размер и потребляемую мощность, а также быть оборудован источником для получения молекулярных комплексов. Группа проф. Кукса работает над созданием миниатюрного радиочастотного масс-спектрометра в форме цилиндрической ионной ловушки небольшого размера, с малым потреблением энергии и не предъявляющей высоких требований к вакууму. В лабораторных исследованиях по развитию метода мы планируем использовать два прибора: коммерческий радиочастотный масс-спектрометр LCQ фирмы Финниган и масс-спектрометр ионного циклотронного резонанса с преобразованием Фурье. Хотя масс-спектрометр ионного циклотронного резонанса не может быть использован в орбитальных условиях, этот метод более универсален и позволяет достигать равновесных условий при изучении кластеров, а, следовательно, проводить измерения кинетики и термодинамики.

       Миниатюризация радиочастотного масс-спектрометра с цилиндрической ловушкой.

       Масс - спектрометрия стала обычным  методом при исследовании планет. Прогресс, достигнутый в этой области за последнее время, дает основание считать, что в ближайшем будущем миниатюрные приборы с малым весом и потребляемой энергией займут достойное место в планетарных исследованиях. Мобильная, легкая и эффективная с точки зрения потребления энергии комбинация хроматографии и масс - спектрометрии широко используется для детектирования и анализа атмосферы, воды и почвы in situ. Целью работ, проводимых в настоящее время, является создание простой и миниатюрной цилиндрической ионной ловушки, которая в то же время обладает высокими характеристиками при решении проблемы распознавания хиральности. Был достигнут значительный прогресс, в частности создана цилиндрическая ионная ловушка размером 1 см. К последним результатам можно также отнести создание цилиндрической ловушки размером 2.5 мм (Бэдмэн и др. 1998).