Циклический гидроксиламин 1-гидрокси-2,2,5,5-тетраметил-4-фенил-3-имидазолин-3-оксид перспективная спиновая ловушка для регистрация активных форм кислорода
, ,
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки
Институт биохимической физики им. Российской академии наук (ИБХФ РАН), г. Москва, *****@***com
Понятие «активные формы кислорода (АФК)» объединяет в себе синглетный кислород (1O2), кислородсодержащие радикалы и органические и неорганические перекиси, химическая активность которых определяется наличием неспаренного электрона на внешнем электронном уровне [1]. АФК образуются в живой клетке как продукты метаболизма кислорода [1–3]. Некоторые АФК могут играть роль медиаторов важных внутриклеточных сигнальных путей [4]. Повышенная продукция АФК может приводит к негативным последствиям для организма. Так синглетный кислород обладает высокой окислительной способностью в отношении ненасыщенных органических субстратов. В условиях избытка 1O2 может привести к гибели клеток [5, 6].
Исследования методом ЭПР спиновых ловушек широко используются для однозначного обнаружения различных радикальных состояний, в том числе АФК и, в частности, синглетного кислорода [7]. К сожалению, детектирование 1O2 методом ЭПР спиновых ловушек имеет ряд ограничений из-за медленной кинетики взаимодействия 1O2 со стандартными спиновыми ловушками (DMPO, DEPMPO) с нитронной группой (~30 л∙моль-1с-1) и быстрой гибели радикального состояния ловушки со скоростью t1/2 = 50 с (восстановление радикального фрагмента ловушки до гидроксиламина или окисление до вторичного нитрона) [8]. В настоящей работе в качестве спиновой ловушки было предложено использовать циклический гидроксиламин 1-гидрокси-2,2,5,5-тетраметил-4-фенил-3-имидазолин-3-оксид (HOTMPIO) (рис. 1, структура I). Ранее [9] было показано, что циклические гидроксиламины могут эффективно захватывать синглетный кислород и формировать стабильные нитроксильные радикалы со значительно более продолжительными временами жизни, чем радикальные аддукты нитронных ловушек. Кроме того, скорость реакции циклических гидроксиламинов с молекулами синглетного кислорода (~103 – 104 л моль-1∙с-1) более чем в 100 раз превосходит скорость взаимодействия 1O2 с нитронными спиновыми ловушками [10]. К недостаткам циклических гидроксиламинов можно отнести их неспецифичность при формировании радикальных аддуктов.
Активность спиновой ловушки HOTMPIO по захвату короткоживущих гидроксильных радикалов и активных форм кислорода проверяли на модельных системах. Для генерации перекисного радикала проводили реакцию Фентона: разложение перекиси водорода в присутствие ионов двухвалентного железа. Активные формы кислорода и, в частности, синглетный кислород (1O2) получали стационарным фотолизом красителя бенгальский розовый (RB), а также фотолизом катионных полиметиновых красителей 3,3’-диэтилтиакарбоцианиниодида (DTCI) и 3,3’,9-триэтил-5,5`-диметилоксакарбоцианиниодида (EDOCI) находящихся в комплексах с ДНК (рис. 1, структуры II-IV).
Рис. 1 Структурные формулы спиновой ловушки HOTMPIO (I), красителей-фотосенсибилизаторов АФК RB (II), DTCI (III) и EDOCI (IV).
МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТА
Спиновая ловушка HOTMPIO была синтезирована в ИБХФ РАН Шапиро имеет ограниченную растворимость в воде в концентрации не более 1.0∙10-3 моль∙л-1. При проведении экспериментов ловушку предварительно растворяли в воде в концентрации 1.0∙10-3 моль∙л-1 и вводили в образцы в концентрации 2.0∙10-4 моль∙л-1.
Для проведения реакции Фентона использовали 3% раствор перекиси водорода и сульфат железа (II) (хч). К водному раствору ловушки в концентрации 2.0∙10-4 моль∙л-1 добавляли раствор перекиси водорода в концентрации 1.0∙10-4 моль∙л-1, после чего к смеси добавляли раствор сульфата железа (II) в концентрации 1.0∙10-4 моль∙л-1.
Для фотохимической генерации АФК использовали коммерческий краситель бенгальский розовый (Sigma, США) и полиметиновые красители (DTCI и EDOCI), синтезированные в предоставленные научномым центреом НИИХИМФОТОПРЕКТ (). В работе использовали коммерческую ДНК (ДНК цыпленка, Реанал, Венгрия). Концентрация ДНК определялась с использованием коэффициента экстинкции пары оснований (ε) 13200 л∙моль–1∙см–1 при длине волны 250 нм [11]. В качестве растворителей использовали водный раствор фосфатного буфера (pH 7, концентрация 20 ммоль∙л–1). Измерения спектров поглощения красителей проводились на спектрофотометре СФ-2000 (Россия) в стандартных кварцевых кюветах (1 см).
Спектры ЭПР спиновой ловушки регистрировали на спектрометре X-диапазона Bruker EMX 8.2/7. Мощность СВЧ составляла 1 мВт, а амплитуда модуляции 1 Гс. В качестве внешнего эталона использовали ионы Mn2+ в решетке магния.
Образцы оcвещали кварцевой галогеновой лампой КГМ 9 75 (Россия). Световой поток, проходящий сквозь образец, фокусировался линзой и составлял 88 лм. Для деаэрирования изучаемых растворов использовали вакуумную установку. Все измерения проводились при комнатной температуре (23 ± 3°С).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Спиновая ловушка HOTMPIO (рис. 1) имеет два активных центра, способных участвовать в реакции с короткоживущими радикальными состояниями. К ним относятся циклический hydroxylamines в первом положении имидазолинового цикла (центр I), и нитронная группа в третьем положении (центр II). Предполагалось, что HOTMPIO может выступать в качестве спиновой ловушки как за счет гидроксильной группы так и за счет нитронной группы.
При растворении ловушки в воде в исходной системе регистрируется низкоинтенсивный спектр ЭПР, который представляет собой изотропный триплет с g-фактором 2.0054(1) и Aiso= 15.40(5) Гс (рис. 2а). Такие спектры характерны для стабильных нитроксильных радикалов иммидазолинового ряда, в которых в качестве заместителей выступают метильные группы [12]. Можно говорить, что При растворении HOTMPIO происходит частичный отрыв атома водорода циклического гидроксиламина (центр I) с формированием стабильного нироксильного радикала 2,2,5,5-тетраметил-4-фенил-3-имидазолин-3-оксид-1-оксил (OTMPhIO, рис. 2б). Равновесие в системе ловушка-радикал в водном растворе наступает в течение нескольких часов.
Захват короткоживущих радикалов центром I ловушки должен приводить к росту амплитуды и интегральной интенсивности исходного сигнала ЭПР без изменения тонкой структуры его спектра. В случае активного участия центра II в реакции захвата радикалов тонкая структура спектра ЭПР должна существенно усложняться за счет появления дополнительной радикальной группы в структуре одного цикла. Реакция нитронной группы с супероксидрадикалом приводит к существенному росту
мультиплетности спектра ЭПР ловушки [13].
Рис. 2 Спектр ЭПР радикала (а), формирующегося при переходе ловушки HOTMPIO в радикальное состояние OTMPIO (б).
Взаимодействие HOTMPIO и перекисных радикалов (реакция Фентона).
В реакции Фентона формируются короткоживущие перекисные радикалы (hydroxyl radical), которые могут вступать в реакцию с исследуемой спиновой ловушкой [11]. В ходе эксперимента спектры ЭПР ловушки регистрировали до добавления реактива Фентона в систему (начальная интенсивность сигнала ЭПР) и через 5, 30, 90 и 150 минут после добавления соли железа (II) к раствору ловушки с перекисью водорода.
Добавление соли железа (II) к раствору HOTMPIO с перекисью в воде приводит к росту амплитуды сигнала OTMPIO на 0.6 отн. единиц от начальной амплитуды сигнала в течении 30 мин, что свидетельствует о реакции ловушки с hydroxyl radicals. При этом внешний вид спектра не изменяется. ЭПР спектры представляют собой триплет, характерный для стабильных нитроксильных монорадикалов (рис. 1а). Можно предположить, что нитронная группа в третьем положении имидазолинового цикла не участвует в реакции с hydroxyl radicals, а реакция проходит по центру I HOTMPIO.
Обнаружено, что в отличие от нитронных ловушек [13] изменение кислотности среды в пределах от pH 4.0 (0.1 М фосфат-цитратный буфер) до pH 8.0 (0.1 М фосфатный буфер) не влияет на вид спектра HOTMPIO. Отметим, что в щелочной среде равновесие ловушка-радикал довольно существенно смещается в сторону формирования радикала. В кислой среде ловушка оказывается более устойчивой; в течении 24 часов не происходит существенного изменения амплитуды сигнала ЭПР ловушки. Тогда как при pH 8.0 через 24 часа амплитуда сигнала ЭПР ловушки изменилась более, чем на 1.5 отн. единиц (при начальной интенсивности 1.3 отн. единиц).
Взаимодействие HOTMPIO и активных форм кислорода (фотолиз красителя бенгальский розовый).
Взаимодействие ловушки с АФК было показано на примере систем с красителями-фотосенсибилизаторами АФК и, в частности, синглетного кислорода. Известно, что эффективные фотосенсибилизаторы 1O2 должны обладать высоким коэффициентом поглощения в спектральной области возбуждающего света, высокими квантовыми выходами интеркомбинационной конверсии в триплетное состояние (при этом уровень триплетного состояния красителя должен быть выше 8000 см-1), время жизни возбужденного триплетного состояния фотосенсибилизатора в растворе должно быть достаточно долгим (~10-3 с). Соединения, претендующие на роль фотосенсибилизаторов, должны показывать высокую фотостабильность [14].
Краситель бенгальский розовый и его производные хорошо известны в качестве фотосенсибилизаторов синглетного кислорода [14, 15]. В водном растворе квантовый выход реакции образования синглетного кислорода для RB высок и составляет 75%. В ходе экспериментов концентрация ловушки в системе составляла 2.0∙10-4 моль∙л-1, начальная концентрация красителя была 8.5∙10-6 моль∙л-1, изменение концентрации красителя при фотолизе контролировали по спектрам поглощения. Отметим, что RB имеет хорошую фотостабильность: за 35 минут фотолиза оптическая плотность раствора RB уменьшилась на ~ 30% (рис. 3, кривая 2).
При фотолизе RB в присутствии ловушки наблюдался существенный рост амплитуды сигнала OTMPIO на 4.8 отн. единицы после 30 минут фотолиза (рис. 3, кривая 1). В отсутствии красителя RB освещение раствора ловушки не приводило к изменению амплитуды сигнала ЭПР. Доказательством решающего влияния активных форм кислорода на рост амплитуды сигнала радикального состояния ловушки при фотолизе RB являются эксперименты, проводимые в условиях форвакуума (10-2 – 10-3 атм.). Фотолиз растворов RB в форвакууме не приводил к существенному росту амплитуды сигнала OTMPIO (рис. 3, кривая 2).
Рис. 2. Изменение амплитуды сигнала OTMPIO в присутствии красителя RB при фотолизе в воздушно-насыщенных растворов (1) и в условиях форвакуума (2), изменения оптической плотности образца краси
Обнаружение активных форм кислорода при фотолизе тиа - и оксакарбоцианиновых красителей в комплексах с ДНК.
Для качественной оценки эффективности детектирования АФК ловушкой HOTMPIO выполнены эксперименты по фотолизу систем, содержащих тиа - и оксакарбоцианиновые красители и ДНК. Фотофизические и фотохимические свойства красителей DTCI и EDOCI в комплексах ДНК были изучены ранее [16 – 19]. Нековалентное взаимодействие тиа - и оксакарбоцианиновых красителей с ДНК может сопровождаться генерацией АФК, поскольку образование комплексов с ДНК затрудняет процессы фотоизомеризации и колебательной дезактивации в возбужденных молекулах красителей, что приводит к возрастанию квантового выхода триплетного состояния их молекул, и дает возможность регистрировать спектры Т-Т поглощения связанных красителей непосредственно при прямом фотовозбуждении [16, 19].
В ходе экспериментов с DTCI концентрация ловушки HOTMPIO в фотохимической системе составляла 2.0∙10-4 моль∙л-1, начальная концентрация красителя была 4.5∙10-6 моль∙л-1, в процессе фотолиза концентрация DTCI падала (краситель выцветал). За 30 минут фотолиза оптическая плотность раствора DTCI уменьшилась на 85% при cDNA = 1.75∙10-4 моль∙л-1, и на 70% при cDNA = 3.5∙10-4 моль∙л-1. При фотолизе воздушно-насыщенных растворов амплитуда сигнала OTMPIO растет: в образце с концентрацией ДНК 1.75 10-4 моль л-1 сигнал увеличивается на 0.47 отн. единиц за 30 минут фотолиза, в образце с сДНК = 3.5∙10-4 моль∙л-1 так же наблюдается увеличение сигнала на 0.47 отн. единиц, но за 60 мин фотолиза. Контрольные эксперименты, проведенные в условиях форвакуума (без кислорода), показали, что интенсивность сигнала ЭПР ловушки остается практически неизменной (нет образования АФК), отсутствие роста сигналов в спектрах наблюдалось при фотолизе раствора DTCI без ДНК (данные не приведены).
В ходе экспериментов с EDOCI начальная концентрация красителя была 2.5∙10-6 моль∙л-1, концентрация ДНК составляла 1.2∙10-4 моль∙л-1. Рост амплитуды сигнала ЭПР ловушки в этой системе составил 0.35 отн. единиц. Предположительно оксакарбоцианиновый краситель будет демонстрировать меньшую эффективность как фотосенсибилизатор при образовании АФК по сравнению с тиакарбоцианиновыми красителями.
Рис. 3. Изменения амплитуды сигнала ЭПР OTMPIO при фотолизе воздушнонасыщенных растворов ДНК-DTCI (1, 2), эксперименты в условиях форвакуума (3, 4). Зависимости (4, 6) показывают уменьшение оптической плотности красителя DTCI при фотолизе. В растворах DTCI концентрация ДНК составляла 1.75∙10-4 моль∙л-1 (1, 3, 5), 3.50∙10-4 моль∙л-1 (2, 4, 6).
Путем экстраполяции прямыми линиями начальных участков зависимостей интенсивности сигнала OTMPIO (рис. 2 и 3) была оценена относительная скорость образования АФК при фотолизе DTCI и EDOCI, и, соответственно, получены процентные показатели относительной эффективности образования радикалов Erel. (Erel. для RB было принято за 100%). При определении Erel. для DTCI и EDOCI были учтены различные оптические плотности красителей в образцах и различные величины интегралов перекрывания спектров поглощения красителей и спектра испускания источника. В случае красителя DTCI величины Erel. АФК составляют 16% и 36 % при cDNA = 1.75∙10-4 моль∙л-1 и при cDNA = 3.5∙10-4 моль∙л-1 соответственно. Эти различия в величине Erel. обусловлены ростом концентрации красителя связанного в нековалентный комплекс с ДНК при большей концентрации ДНК. Известно [сошлитесь на себя!], что краситель в растворе находится в условиях равновесия между свободной формой и комплексом с ДНК, а увеличение концентрации ДНК смещает равновесие в сторону формирования нековалентных комплексов. Таким образом, при фотолизе в системе с большей концентрацией ДНК должно образовываться больше триплетных молекул красителя, способных генерировать АФК. Для красителя EDOCI при cDNA = 1.2∙10-4 моль∙л-1 величина Erel. меньше, чем для красителя DTCI при сравнимой концентрации ДНК и составляет всего 5%. Меньшие значения Erel. можно объяснять как более низким по сравнению с DTCI значением константы комплексообразования с ДНК (есть ли данные???), так и более низким квантовым выходом интеркомбинационной конверсии в триплетное состояние красителя [20].
Спектры ЭПР ловушки, полученные при фотолизе в системах, содержащих красители сохраняют вид характерный для стабильных нитроксильных монорадикалов (рис. 1 а), т. е. происходит переход гидроксиламина в радикальное состояние (реакция по центру I). Во всех описанных экспериментах не было получено свидетельств в пользу образования радикальных форм ловушки за счет реакции с участием нитронной группы (центр II).
Известно, что циклические гидроксиламины обладают более высокой реакционной способностью, чем нитрон, а формирующиеся в результате отрыва атома водорода радикалы обладают более высоким временем жизни, чем радикальные аддукты формирующиеся в результате реакции нитрона с короткоживущими радикалами. Кроме того, нитронная группа в положении 3 имидазолинового цикла в сочетании с фенилом в 4 положении и двумя метильными группами в положении 2 оказывается стерически затрудненной и слабо вступает в реакции с радикалами [20].
Предлагаемая в работе спиновая ловушка (HOTMPIO) оказывается перспективной для анализа систем, содержащих ПР и АФК. К достоинствам ловушки можно отнести: высокую чувствительность, растворимость в воде, стабильность в растворах, высокую эффективность детектирования короткоживущих радикалов, стабильность радикального состояния ловушки.
Авторы выражают благодарность проф. (НЦ НИИХИМФОТОПРОЕКТ) за предоставление полиметиновых красителей.
Спектры ЭПР были получены на оборудовании ЦКП «Материалы и технологии» ИБХФ РАН.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований, проект № 16-03-00735.
Литература
[1] Devasagayam T., Tilak J. C., Boloor K. K., Sane Ketaki S., Ghaskadbi Saroj S., Lele R. D. Free Radicals and Antioxidants in Human Health: Current Status and Future Prospects. Journal of Association of Physicians of India (JAPI) 2004. V. 52: 796.
[2] Turrens J. F. Mitochondrial formation of reactive oxygen species. J. Physiol. (Lond.) 2003. V. 552. Pt. 2. P. 335 – 344.
[3] Muller F. The nature and mechanism of superoxide production by the electron transport chain: Its relevance to aging. Journal of the American Aging Association. 2000. V. 23. № 4. P. 227 – 253.
[4] Suzuki Y. I., Forman H. J., Sevanian A. Oxidants as stimulators of signal transduction. Free Rabic. Biol. Med. 1997. V. 22. No. 1 – 2. P. 269 – 285.
[5] Laloi C., Havaux M. Key players of singlet oxygen-induced cell death in plants. Front Plant Sci. 2015. V. 6: 39.
[6] Stadtman E. R. Protein oxidation and aging. Science. 1992. V. 257 (5074). P. 1220– 1224.
[7] Matsumura Yu., Iwasawa A., Kobayashi T., Kamachi T., Ozawa T., Kohno M. Detection of High-frequency Ultrasound-induced Singlet Oxygen by the ESR Spin-trapping Method. Chemistry Letters. 2013. V. 42. №10. P. 1291 - 1293.
[8] G. E. Buettner. On the Reaction of Superoxide with DMPO/OOH. Free Rad. ms. 1990. V. 10. N 1-2. P.-11-15.
[9] Kozuleva M., Klenina I., Mysin I., Kirilyuk I., Opanasenko V., Proskuryakov I., Ivanov B. Quantification of superoxide radical production in thylakoid membrane using cyclic hydroxylamines. Free Radical Biology and Medicine. 2015. V. 89. P. 1014 – 1023.
[10] Dikalov S, Skatchkov M, Bassenge E. Spin trapping of superoxide radicals and peroxynitrite by 1-hydroxy-3-carboxy-pyrrolidine and 1-hydroxy-2,2,6, 6-tetramethyl-4-oxo-piperidine and the stability of corresponding nitroxyl radicals towards biological reductants. Biochem. Biophys. mun. 1997. V. 231(3), P. 701-4.
[11] Baguley B. C., Falkenhang E.-M. The interaction of ethidium with synthetic double-stranded polynucleotides at low ionic strength. Nucleic Acids Res. 1978. 5. P. 161-171.
[12] A. A. Bobko, I. A. Kirilyuk, N. P. Gritsan, D. N. Polovyanenko, I. A. Grigor’ev, V. V. Khramtsov, E. G. Bagryanskaya. EPR and Quantum Chemical Studies of the pH-sensitive Imidazoline and Imidazolidine Nitroxides with Bulky Substituents. Appl. Magn. Reson. 2010 December 1; 39(4): 437–451.
[13] G. I. Skubnevskaya, G. G. Dul'tseva, G. I. Shohukin, L. B. Volodarskii. Influence of pH on eprspectraof radical adducts with a new spin trap 1,2,2,5,5-pentamethyl-3-1midazoline-3-oxide. Translated from Izvestiya Akademii Nauk SSSR, Seriya Khimicheskaya, 1987. N. 2, pp. 312-317.
[14] DeRosa M. C., Crutchley R. J. Photosensitized singlet oxygen and its applications. Coordination Chemistry Reviews. 2002. V. 233/234. P. 351 – 371.
[15] Redmond R. W., Gamlin A compilation of singlet oxygen yields from biologically relevant molecules. Photochem. Photobiol. 1999. V. 70. № 4. P. 391 – 475.
[16] Anikovskii, M. Yu., Tatikolov, A. S., Shvedova, L. A., and Kuz’min, V. A. Photochemical investigation of the triplet state of 3,3`-diethylthiacarbocyanine iodide in the presence of DNA. Russ. Chem. Bull., Int. Edition 2001, V. 50, no. 7, p. 1190 - 1193.
[17] Pronkin P. G., Tatikolov A. S., Sklyarenko V. I., Kuz’min, V. A. Photochemical properties of meso-substituted thiacarbocyanine dyes in solutions and in complexes with DNA. High Energy Chemistry. 2006. V. 40 no. 4. P. 252 – 258.
[18] Pronkin P. G., Tatikolov A. S., Sklyarenko V. I., Kuz’min, V. A. Quenching of the triplet state of meso-substituted thiacarbocyanine dyes by nitroxyl radicals, iodide ions, and oxygen in solutions and in complexes with DNA. High Energy Chemistry. 2006. V. 40 no. 6. P. 403-409.
[19] Pronkin P. G., Tatikolov A. S. Photochemical Properties of Oxacarbocyanine Dyes in Solutions and in Complexes with DNA. High Energy Chemistry, 2015, Vol. 49, No. 5, pp. 328–330.
[20] eishi, D. Yoshioka, Ch. Yoshioka, Sh. Yamamoto, Y. Kotake. High static pressure alters spin trapping rates in solution. Dependence on the structure of nitrone spin traps. Org. Biomol. Chem., 2006, Vol. 004, P. 896-901.
