Ф. (Тюлькина) Дина Васильевна
Аспирант или молодой ученый: аспирант 3-его года обучения
Место работы: Лаборатория структуры и функций генов человека ИБХ РАН
Планируемая работа:
Направление модернизации: Медицинские технологии, прежде всего диагностическое оборудование, а также лекарственные средства
Характер научного исследования: Прикладной
Тема научного исследования: Использование FAP-позитивных опухоль-ассоциированных фибробластов для внутриопухолевой активации цитотоксических пролекарств
Ключевые слова, характеризующие тематику научного исследования: рак, генная терапия, протоксин, опухоль-ассоциированные фибробласты (ОАФ), белок активации фибробластов FAP, микроокружение опухоли
Формулировка решаемой проблемы:
Несмотря на прогресс хирургических методов, химиотерапии и радиотерапии, рак остается второй ведущей причиной смертности после сердечно-сосудистых заболеваний. В настоящее время медицина располагает эффективной и токсичной химиотерапией и низкоэффективной таргетной терапией. Поэтому существует острая необходимость в развитии принципиально новых подходов к терапии опухолей.
На данный момент опухоль все чаще рассматривают как сложный "орган", в который, как единая совокупность, входят раковые и окружающие их, в частности, стромальные клетки. Строма (микроокружение опухоли) представляет собой сложную систему, в которую входят, иммунные, эндотелиальные, мезенхимальные стволовые клетки, и опухоль-ассоциированные фибробласты (ОАФ). ОАФ представляют собой мезенхимальные веретенообразные наиболее многочисленные клетки опухолевой стромы и являются одним из ее важнейших элементов. Для ОАФ высоко специфична экспрессия белка активации фибробластов (FAP). В серии экспериментов с использованием человеческих тканей, FAP был обнаружен в строме более 90% типов злокачественных опухолей. Показано, что FAP практически не детектируется в большинстве нормальных тканей, его высокая экспрессия характерна только при эмбриональном развитии. Таким образом, FAP является крайне привлекательной терапевтической мишенью. FAP представляет собой сериновую протеазу, обладающую протеолитической и интернализующей активностями. В рамках противоопухолевой терапии существуют стратегии, направленные на таргетирование ОАФ посредством воздействия на их характеристический маркер – FAP.
Данный проект посвящен разработке принципиально нового подхода к лечению рака, подразумевающего направленное использование FAP-позитивных ОАФ. При этом планируется создавать из ОАФ постоянные источники противоопухолевых агентов посредством использования ферментативной активности белка FAP. В случае успеха ОАФ в качестве постоянного источника противоопухолевых агентов (цитостатиков, активаторов противоопухолевого иммунного ответа и пр.) могут значительно способствовать снижению устойчивости солидных опухолей к стандартному лечению.
Основное содержание научного исследования:
На начальном этапе работы будет произведен выбор адекватной модельной системы, на которой в дальнейшем будут проведены планируемые эксперименты. В качестве модели будет выступать опухолевый материал, извлеченный из мышей (BALB/c, C57BL и др.) через 2-4 недели после их инокуляции опухолевыми клетками (LLC, C26, LLMet и др.). Наличие наиболее сформированного опухолевого микроокружения является основным критерием при выборе модели, поэтому в образцах будет проведено сравнение уровня экспрессии генов основных маркеров опухолевого микроокружения таких, как б-SMA, FSp1, Cspg4, Pdgfrb, а также белка Fap.
В основу данного исследования положена протеолитическая активность Fap при создании FAP-активируемых протоксинов. В данном случае пролекарство представляет собой неактивный цитотоксический агент, соединенный с пептидом, содержащим последовательность для расщепления протеазой FAP. Принцип действия данного подхода продемонстрирован на примере пролекарства Z-GP-Dox (Z, это N-карбоксибензильная группа (N-carbobenzoxy-Gly-Pro-Dox)), содержащего химиотерапевтический агент доксорубицин. Z-GP-Dox – это модифицированный дипептид, содержащий на С-конце пролиновый остаток, присоединенный к аминогруппе доксорубицина. Такой конъюгат нетоксичен. При воздействии протеазы FAP связь между пептидом и доксорубицином разрушается, и высвобождается активный доксорубицин. Сейчас еще рано судить об эффективности такого пролекарства, однако его токсичность намного ниже, чем у доксорубицина. Поэтому в начале на выбранной модельной системе будут отработаны условия экспериментальных подходов на модифицированном доксорубицине: определение чувствительности используемых опухолевых клеток к самому доксорубицину при помощи цитотоксического теста, а далее оценка с использованием ВЭЖХ способности опухолевого гомогената конвертировать модифицированный доксорубицин в токсин при инкубации посредством ферментативной активности мышиного Fap.
После получения отработанных условий с модифицированным доксорубицином на выбранной модельной системе, будет проведен отбор нового цитотоксического агента из ATX групп L01A (алкилирующие препараты), L01B (антиметаболиты), L01D (противоопухолевые антибиотики) или др., который будет подвергнут модификации с целью получения неактивного пролекарства, где агент будет соединен с пептидом, содержащим последовательность для расщепления протеазой Fap. Синтез протоксина будет выполнен в лаборатории ИМГ РАН (рук. ). Синтезированное пролекарство будет проверено на снижение токсичности по сравнению с исходным агентом на опухолевых клетках. Будет проведен анализ конверсии полученного протоксина в токсин посредством протеолитической активности Fap в выбранной модельной системе, а также противоопухолевая активность препарата будет оценена на животных с привитыми опухолями.
План исследования:
1. Подкожное введение опухолевых клеток (LLC, C26, LLMet и др.) мышам различных типов (BALB/c, C57BL и др.) с поэтапным отслеживанием формирования опухолей.
2. Определение уровня транскрипции генов б-SMA, FSp1, Cspg4, Pdgfrb, а также Fap с использованием ПЦР в режиме реального времени. На основе анализа полученных данных выбор адекватной модельной системы.
3. Проведение цитотоксического теста на чувствительность опухолевой клеточной линии, использованной в выбранной модельной системе, к химиотерапевтическому агенту доксорубицину.
4. Оценка с использованием ВЭЖХ способности превращения модифицированного доксорубицина в токсин.
5. Литературный анализ, выбор и синтез подходящего противоопухолевого агента.
6. Оценка токсичности синтезированного пролекарства: сравнение результатов цитотоксического теста на чувствительность опухолевых клеток как к самому токсину, так и к его модифицированной форме.
7. Провести анализ влияния полученного пролекарства в выбранной модельной системе, а также на животных с привитыми опухолями: оценить наличие протоксина/токсина в образцах и степень конверсии препарата.
Научные достижения и личное участие претендента в осуществлении перспективных научных исследований:
Перечень публикаций в Web of Science, Scopus:
1. , , Свердлов промоторов для целей генной терапии опухолей с высоким стромальным содержанием.// Acta Naturae, 2014, спецвыпуск №1, с. 63.
2. , , Свердлов -факторы транскрипции в нормальном развитии и в канцерогенезе.// Биоорганическая химия, 2015, Т. 41, № 6, стр. 636-643.
3. , , Свердлов – регуляторы регуляторных генов развития и рака?// Молекулярная биология, 2015, Т. 49, №6, с. 915-922.
4. , , Свердлов раковых мутаций: поправимая плохая жизнь или неизбежные стохастические ошибки репликации?// Молекулярная биология, 2016, Т. 50, № 6, с. 1–16.
5. , , Свердлов активации фибробластов FAP как возможная мишень в противоопухолевой стратегии.// Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 2016, №3, с. 90-97.
6. , , академик РАН Свердлов гена FAP в нефибробластных клеточных линиях человека – создание моделей опухоль-ассоциированных фибробластов.// Доклады Академии Наук, 2016, Т. 470, № 1, с. 105–107.
7. D. V. Antonova, V. V. Pleshkan, and E. D. Sverdlov. Search for cell lines to be used as models of cancer-associated fibroblasts. // The FEBS Journal, 284 (Suppl. 1), 2017, p. 267. doi: 10.1111/febs.14174
Перечень публикаций в РИНЦ:
1. Тюлькина рекомбинантных конструкций для исследования влияния гена CCN2 на миграционную активность опухолевых клеток при раке поджелудочной железы // Мед. академ. жур., 2016, Т. 6, №4, стр.67-68.
Участие в конференциях 2014-2017 гг.: 2 российские и 5 международные конференции
Участие в проектах:
РФФИ №16-04-01842: «Исследование функционального статуса трансгена, экспрессируемого в течение длительного времени в клетках опухоли поджелудочной железы», 2016-2018 гг.
РФФИ №16-34-01222 мол_а: «Исследование влияния факторов, экспрессируемых фибробластами, на подвижность клеток рака поджелудочной железы», 2016-2016 гг.
РФФИ №15-04-07773: «Поиск промоторов генов, обладающих повышенной экспрессией в клетках стромы опухоли», 2015-2015 гг.
РФФИ №15-04-04589: «Исследование влияния направленных модификаций положительно заряженных рекомбинантных белков на эффективность внутриклеточного транспорта их комплексов с ДНК», 2015-2017 гг.
РНФ №14-50-00131: «Мастер-регуляторные белки и гены развития и канцерогенеза на примере поджелудочной железы», 2014-2018 гг.
