Биотрансформация органических веществ

Лекция 12

БИОТРАНСФОРМАЦИЯ ОРГАНИЧЕСКИХ  ВЕЩЕСТВ

       Современная биотехнология рассматривает биотрансформацию органических веществ в новые соединения при помощи микроорганизмов и ферментов как самостоятельный раздел, ибо существует специфика реализации самого процесса, в отличие процессов биосинтеза и брожения, в которых участвует большое количество ферментов, в микробиологической трансформации обычно участвует один определенный фермент, катализирующий окисление, декарбоксилирование, метилирование и другие реакции. Чтобы произвести трансформацию какого-либо вещества, вначале размножают культуру соответствующего микроорганизма до количества, составляющего 5-10% объема трансформируемого раствора. При подготовке раствора для трансформации веществ необходимо учитывать, что, во-первых, в нем надо растворить максимально возможное количество трансформируемого вещества (обычно10-25%) и, во-вторых, надо использовать минимальное количество необходимых для развития культуры питательных солей, причем в таком виде, чтобы не было затруднено химическое выделение вещества. Если трансформируемое вещество не растворяется в воде, его предварительно растворяют в нейтральном органическом растворителе, а затем при интенсивном помешивании смешивают с основной средой.

Трансформацию ведут в стерильных условиях, при поддерживании оптимума рН, температуры и других факторов. Процесс длиться обычно 0,5-2 суток.

После микробиологической трансформации следует химическое выделение вещества. Технологические методы трансформации органических соединений можно разделить на следующие группы:

1. Использование не размножающихся клеток.

2. В периодических условиях с использованием растущей культуры.

3. Использование спор.

4. Применение дезинтегрированных клеток.

5. При помощи иммобилизированных клеток микроорганизмов.

6. С использованием выделенных из микроорганизмов ферментных препаратов, в том числе иммобилизированных.

7. Непрерывные методы.

Покажем трансформацию некоторых органических веществ микроорганизмами.

Субстрат	Продукт	Микроорганизмы	Выход
Сорбит	Сорбоза	98
Глицерин	Дигидроксиацетон	Gluconobacter	90
Глюкоза	5-кетоглюконовая к-та	Suboxydans	90
Маннит	Фруктоза	95
Глюкоза	Глюконовая к-та	Aspergilus niger	100
Д-фенилаланин	L-фенилаланин	Ps. miyamiry	97
Д, L-пироглута- миновая к-та	L-глутаминовая к-та	Ps. alkaligenes	90
Глюкоза	2-кетоглюконовая к-та	Ps. fragilis	92
Прогестерон	112-гидроксипрогестерон	Rhizopus nigricans	90
Малеиновая к-та	Фумаровая к-та	Alcaligenes faecalis	90
Сорбит	Фруктоза	Baccilus fruceosus	92

Микробиологическую трансформацию начали активно применять после 1934 года, когда было выяснено, что с помощью культуры Acetobacter suboxydans из Д-сорбита можно получить L-сорбозу, необходимую для синтеза аскорбиновой кислоты.

Для трансформации Д-сорбита в L-сорбозу нужно провести окислительный процесс, катализаторами которого в биохимической реакции обычно являются дегидрогеназы. Эту реакцию осуществляют многие виды Acetobacter-xylinum, suboxydans, mesoxydans, melanogenum-последняя особенно активна.

Практическое и теоретическое значение имеют получение и преобразование физиологически активных стероидов, например, холестерина, эргостерона, половых гормонов( тестостерона, прогестерона), а также гормонов надпочечников – кортикостерона и его производного – кортизона. Культура Tieghemelle orchidis в условиях глубинного культивирования при содержании растворенного в среде азота 5-6 мг/л в течение суток образует до 6 г/л сухого мицелия. Наибольшей трансформирующей способностью обладает 17 часовая культура. За 10 часов такая культура трансформирует до 70%  соединения Рейхштейна S, при этом выход гидрокортизона составляет 52%.

Методом биокатализа получают из арахидоновой кислоты простогландины, тромбоксины, простациклин и лейкотриены. Эти вещества как регуляторы важнейших биохимических процессов применяются и в медицине.

Арахидоновая кислота может быть получена из масел ферментативно, с помощью специфических фосфолипидов.

Получение гормонов из соединения Рейхштейна.

Особенности процессов биотрансформации.

Перспективным направлением в биокатализе органических соединений является использование двухфазных систем: вода – несмешивающийся с водой органический растворитель. В такой среде заметно улучшаются термодинамические условия реакций. Двухфазные системы дают хорошие результаты при трансформации малорастворимых в воде соединений, таких как стероиды.

При биотрансформации органических соединений важное значение имеют различные регуляторные механизмы, в том числе индукция и репрессия, а также способность штаммов к мутациям, что может приводить к изменениям трансформирующих свойств.

Существенное значение имеет также проницаемость цитоплазматических мембран, которую иногда регулируют во время выращивания культуры.

Так при конверсии пуринов или пиримидинов в соответствующие нуклеотиды при помощи Brevibacterium ammoniagenes рост культуры лимитируют ионами марганца. Метод лимитации по ионам марганца позволяет изменить проницаемость дрожжей Saccharomyces cerevisia и получить из 10г аденозина 16г АТФ в виде натриевой соли.

Бактериальные клетки Zymomonas mobilis с увеличенной проницаемостью конвертируют сахарозу в два продукта – сорбит и глюконовую кислоту, при каталитическом действии вновь открытого фермента глюкозо-фруктозо-трансгидрогеназы.

В некоторых случаях культуру выращивают на одном субстрате, а конверсию производят на другом. Примером такого кометаболизма служит Pseudomonas sp., которую выращивают на н-гексадекане, а затем используют для превращения н-амилбензена в фенилакриловую кислоту, при этом выход равен 100%.

Необходимо отметить, что практически все биокаталитические трансформации осуществляются при высоком коэффициенте конверсии, состовляющем 0,9-1,0%, как видно из таблицы.

Получение гормонов, вакцин и других препаратов.

Гибридома – это клеточный гибрид, получаемый слиянием нормальной антителообразующей клетки ( лимфоцита ) и опухолевой клетки; обладает способностью к синтезу моноклональных ( однородных ) антител желаемой специфичности ( свойство лимфоцита ), и к неограниченному росту в искусственной среде, что обеспечивает гибридной клетке своеобразное «бессмертие». Моноклональные антитела являются идеальными по специфичности реагентами на ту или иную органическую субстанцию.

После открытий Дженера и Пастера вакцины долгое время производили из органов больных животных ( лимфатические узлы, селезенка). Сейчас многие вакцины получают микробиологическим способом. В настоящее время выпускают свыше 100 различных бактериальных и вирусных профилактических и лечебных препаратов. Для получения противотуберкулезной вакцины БЦЖ, например, возбудитель Mycobacterium tuberculosis культивируют глубинным методом на картофельно-глицериновой среде. Ослабленные клетки лиофилизируют в защитной среде.

Живую вакцину полиемиелита Себина готовят из ослабленных вирусов полиомы и размножают на диплоидных клеточных культурах человека. Новые возможности получения вакцины открывает генетическая инженерия. Чтобы организм не перегружать и не вводить в него нежелательные вещества, представляется возможным при помощи рекомбинантных микроорганизмов продуцировать только один необходимый антиген. Для этого в клетки бактерий и дрожжей вводят необходимый ген. Таким путем уже получены вакцины против ящура, гепатита В, бешенства, гриппа и других болезней.

Для производства вакцинных белков-антигенов можно считать перспективными дрожжи и клетки животных, причем дрожжи значительно проще культивировать, чем животные клетки. В связи с этим внимание заслуживает работа Д. Рутера, который при помощи плазмиды ввел в клетки Saccharomyces cerevisiae ген антигена НВsАg гепатита В.

Для получения вакцин и других иммунопрофилактических и диагностических средств широко используют культуры тканей животных.

Системы культивирования животных тканей и клеток можно разделить на две группы: первая – монослойные, когда клетки развиваются на поверхности стенок посуды (бутылок, матриц) или поверхности специальных носителей, погруженных в питательную среду; вторая – культивируют суспендированные в среде клетки.

Монослойные культуры в производственной практике выращивают в роллерно-бутылочных аппаратах, помещенных в термостатируемые камеры, число бутылок в каждой установке достигает 700, объем системы культивирования достигает сотен литров.

Другая, более современная система монослойного культивирования животных клеток разработана А. Везелем, который в 1987 году доказал, что животные клетки хорошо развиваются на сферических частицах (микроносителях) размером 0,2 мм, изготовленных из ДЭАЭ – сефадекса

  А 50 и покрытых коллодионом.

Микроносители могут быть не только суспендированы, но и закреплены по типу «фиксированного» слоя.

Второй вариант культивирования животных клеток в суспенированном виде во многом схож с обычным глубинным культивированием микроорганизмов. Специфика этой системы хорошо видна на примере получения моноклональных антител.

Широкое применение моноклональных антител в медицине привело к необходимости увеличения этого производства.

Чтобы получить один килограмм моноклональных антител, требуется 20 тысяч мышей, а методом глубинной ферментации такое же количество антител может быть выработано с помощью гибридомных клеток за 10 суток в аппарате, объемом 7 куб. м.

Для культивирования гибридомных клеток применяют синтетические среды специального состава. Среды и воздух стерилизуют при помощи фильтрации. Аппаратура для культивирования гибридомных клеток такая же как для культивирования микроорганизмов. Однако в этих условиях механическое перемешивание нежелательно – лучше использовать эрлифтную систему аэрации.

Гибридомные клетки развиваются хорошо при степени насыщения среды кислородом от 8 до 100 % от полного насыщения. Желательно, чтобы реактор был изготовлен из стекла или гладкой нержавеющей стали. Процесс ферментации длительный, поэтому очень важно обеспечить условия, не допускающие смешивания клеток. Концентрация клеток после ферментации достигает более 10  на 1 мл среды. Фирма «Селтек» реализовала процесс культивирования гибридомных клеток в эрлифтном биореакторе (объем равен 1000 л).

Эрлифтная система для глубинной ферментации клеток гибридомы  ( Fairtlangh, 1985 )

1,2,3 – эрлифтные биореакторы объемом 10, 100, 1000л;

4 – центрифуга;

5 – ультрафильтрационные установки.

Инокулят размножают в реакторе объемом 10л, затем – 100л и заканчивают в реакторе объемом 1000л.

При получении IgG антител с помощью мышиных гибридомных клеток, имеющих период удвоения 20 ч, достигнута концентрация клеток

2 *10  на 1мл среды за 200 часов ферментации. Биосинтез антител сначала идет параллельно с ростом культуры и достигает максимума в фазе отмирания клеток. В ферментаторе объемом 1000 л за 250-400 часов культивирования получают 150 г антител.

Годовое производство моноклональных антител в такой системе составляет 3-5 кг.

                       

Динамика роста клеток гибридомы (1) и образования анти

По окончании ферментации клеточную биомассу отделяют фильтрованием или центрифугированием. Супернатант ( фильтрат ) концентрируют ультрафильрацией – до концентрации антител 1г/л жидкости. Дальнейшая очистка препарата достигается методами осаждения, ионообменной хроматографии. Методы глубинного культивирования гибридомных клеток имеют ряд преимуществ, в частности, меняя объем реакторов, можно получить любые количества моноклональных антител, причем экономически это более выгодно, чем при использовании животных.