Методы анализа, необходимые для проверки состава косметической продукции (VII)

  Приложение

  к Санитарному Регламенту

  о косметических продуктах

МЕТОДЫ АНАЛИЗА,

необходимые для проверки состава косметической продукции (VII)

Методы анализа, необходимые для проверки состава косметической продукции (далее – методы) приведены полностью в соответствии с положениями Седьмой Директивы от 2 июля 1996 года о сближении законов государств-членов, относящихся к методам анализа, необходимых для проверки состава косметической продукции (96/45/ЕЕС), опубликованной в Официальном Журнале Европейских Сообществ (JOCE) L 213/8 от 01.01.01 г.

I. ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ 2-ФЕНОКСИЭТАНОЛА, 1-ФЕНОКСИПРОПАНДИОЛА, МЕТИЛ, ЭТИЛ, ПРОПИЛ, БУТИЛ И БЕНЗИЛ-4-ГИДРОКСИБЕНЗОАТА В КОСМЕТИЧЕСКОЙ ПРОДУКЦИИ

А. ИДЕНТИФИКАЦИЯ

1. ПРЕДМЕТ И ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ

Этот метод описывает процедуру тонкослойной хроматографии, которая в сочетание методом, представленным в разделе В, позволяет идентифицировать 2-феноксиэтанол, 1-феноксипропанол, метил-4-гидроксибензоат, этил-4-гидроксибензоат, пропил-4-гидроксибензоат, бутил 4-гидроксибензоат и бензиловый 4-гидроксибензоат в косметических продуктах.

2. ПРИНЦИП.

Консерванты из подкисленных косметических проб экстрагируются ацетоном. После фильтрации раствор ацетона смешать с водой в щелочной среде, жирные кислоты осаждаются в виде их кальциевых солей. Щелочную смесь ацетон / вода экстрагировать диэтиловым эфиром, чтобы удалить липофильные вещества. После подкисления проб, консерванты экстрагируют диэтиловым эфиром. Аликвоту экстракта диэтилового эфира поместить на хроматографическую пластину тонкослойной  хроматографии ТСХ, покрытую силикагелем. После разгонки хроматографические пластины наблюдать в УФ-свете и визуализировать с использованием реагент  Millon.

3. РЕАГЕНТЫ

3.1. Общие требования.

Все используемые реагенты должны быть аналитической чистоты. Вода должна быть дистиллированной или водой, по меньшей мере, такого же качества.

3.2. Ацетон.

3.3. Диэтиловый  эфир.

3.4. n-Пентан.

3.5. Метанол.

3.6. Уксусная кислота, ледяная.

3.7. Раствор соляной кислоты, с (HCl) = 4 моль/л.

3.8. Раствор гидроксида калия,  (КОН) = 4 моль/л.

3.9. Дигидрат хлорида кальция (CaCl 2 · 2H2O).

3.10. Реактив - проявитель: Millon.

Реагент Millon (нитрат ртути (II)) готовый  реактив, который имеется в продаже (Fluka 69820).

3.11. 2-Феноксиэтанол.

3.12. 1-Феноксипропанол.

3.13. Метил-4-гидроксибензоат (метилпарабен кислота).

3.14. Этил-4-гидроксибензоат (этилпарабен кислота).

3.15. n-Пропил-4-гидроксибензоат (пропилпарабен кислота).

3.16. n-Бутил-4-гидроксибензоат (бутилпарааминобензоевая кислота).

3.17. Бензил-4-гидроксибензоат (бензилпарабен.)

3.18. Приготовление стандартных растворов.

Приготовить в метаноле 0,1% (m/v) раствор каждого из эталонных веществ, указанных в пунктах 3.11, 3.12, 3.13, 3.14, 3.15, 3.16 и 3.17 настоящего раздела.

3.19. Подвижная фаза

Смешать 88 объемов n-пентана (3.4) с 12 объемами ледяной уксусной кислоты (3.6).

4. ОБОРУДОВАНИЕ

Обычное лабораторное оборудование, а также:

4.1. Водяная баня, способная поддерживать температуру 60°С.

4.2. Хроматографическая камера (не выложенная фильтровальной бумагой).

4.3. Источник ультрафиолетового света, 254 nм

4.4. Хроматографические пластины, 20 см х 20 см, предварительно покрытые 0,25 мм силикагелем 60F 254, с зоной концентрирования (Merck nr.11798, Darmstadt или эквивалент).

4.5. Печка, способная поддерживать температуру до 100° С.

4.6. Фен для волос, пропускающий поток горячего воздуха.

4.7. Валик, для подкрашивания шерсти, длина примерно 10 см, внешний диаметр примерно 3,5 см. Толщина слоя шерсти  должна быть от 2 до 3 мм, при  необходимости  можно регулировать.

См. примечание в разделе 5.2.

4.8. Стеклянные пробирки  на  50 мл с винтовой крышкой.

4.9. Электрический нагревательный элемент, с термостатическим регулятором температуры. Контроль температуры: около 80°. Плита покрывается алюминиевой пластиной 20 см Ч 20 см  толщиной около 6 мм, для получения равномерного распределения тепла.

5. ПРОЦЕДУРА

5.1. Подготовка образца

В стеклянной пробирке на 50 мл с винтовой крышкой взвесить около  1 г образца (4.8). Добавить 4 капли раствора соляной кислоты (3.7) и 40 мл ацетона.

Для сильно щелочных косметических продуктов, таких как туалетное мыло, необходимо добавить 20 капель раствора соляной кислоты. Пробирки закрыть, осторожно нагреть смесь до примерно 60° С, чтобы облегчить экстракцию консервантов в фракции ацетона, и энергично встряхивать в течение 1 минуты.

Измерить рН раствора с рН-индикаторной бумагой и рН раствора довести до значения ≤3 с помощью хлористоводородной кислоты. Встряхивать повторно в течение одной минуты.

Раствор охладить до комнатной температуры и профильтровать через фильтровальную бумагу в коническую колбу. 20 мл фильтрата перевести в коническую колбу на 200 мл, добавить 60 мл воды и перемешать. рН смеси довести приблизительно до 10 раствором гидроксида калия (3.8) с использованием индикаторной бумаги.

Добавить 1г дигидрата хлорида кальция (3.9) и энергично встряхнуть. Раствор профильтровать через фильтровальную бумагу в делительную воронку на 250 мл, содержащую 75 мл диэтилового эфира и энергично встряхнуть в течение 1 минуты. Оставить раствор до хорошего разделения фракций, водный слой собрать в коническую колбу на 200 мл. Значение рН раствора довести до приблизительно 2 с помощью раствора соляной кислоты, используя индикаторную бумагу. Затем добавить 10 мл диэтилового эфира и энергично встряхивать в течение 1 минуты. Оставить до хорошего разделения фракций и примерно 2 мл слоя диэтилового эфира перевести в флакон для проб емкостью 5 мл.

5.2. Тонкослойная хроматография

Пластину для тонкослойной хроматографии ТСХ (4.4) поместить на нагретую алюминиевую пластину (4.9). Нагревать по 10 µl из каждого раствора (3.18) и 100 µl раствора пробы (5.1) на линию старта в концентрационной зоне пластины ТСХ.

При необходимости, может быть использован поток воздуха, чтобы облегчить испарение растворителя. ТСХ-пластинку извлечь из нагревательной печи и дать остыть до комнатной температуры. Налить 100 мл подвижной фазы (3.19) в хроматографическую камеру (4.2).

ТСХ пластины немедленно поместить в ненасыщенную хроматографическую камеру и дать элюенту подняться при комнатной температуре до 15см от линии старта. Удалить пластину из хроматографической камеры и оставить сушиться в потоке горячего воздуха с помощью фена.

Пластину рассмотреть под ультрафиолетовым светом (4.3) и отметить пятна  на  пластине. Нагревать пластину в течение 30 минут в печи (4.5) при 100° С, чтобы удалить избыток уксусной кислоты. Консерванты проявляются на пластине с помощью реагента Millon (3.10), путем погружения валика (4.7) в реагент и проведения валиком по TСХ пластине до ее равномерного смачивания.

Примечание. Пятна могут визуализироваться с помощью тщательного применения одной капли реагента Millon на каждый из участков пятна, отмеченных в УФ-свете.

Эфиры 4-гидроксибензойной кислоты проявляются в виде красных пятен, 2-феноксиэтанол и 1-феноксипропанол - в виде желтых пятен. Следует отметить, что сама 4-гидроксибензойная кислота, которая может быть обнаружена в образцах в качестве консерванта или продуктах разложения из радикалов гидроксипарабензоатов, также проявляется в виде красного пятна. См. пункты 7.3 и 7.4 настоящего раздела.

6. ОПРЕДЕЛЕНИЕ

Рассчитать значение R f для каждого пятна. Сравнить пятна, полученные из раствора пробы, с пятнами стандартных образцов с точки R f-значений поведения в УФ-излучении цвета после визуализации. Сделать предварительные выводы о наличие консервантов.

В присутствии радикалов парабензоатов осуществить процедуру высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), описанную в разделе В. Для подтверждения наличия 2-феноксиэтанола, 1-феноксипропандиола и радикалов гидроксипарабензоатов объединить все результаты из ТСХ и ВЭЖХ.

7.  ПРИМЕЧАНИЕ

7.1. Из-за токсичности реагента Millon (этот реагент описан ранее в одной из процедур) опрыскивание им не рекомендуется.

7.2. Другие соединения, содержащие гидроксильные группы, также могут быть окрашены реагентом Millon. Таблицу окрашивания и Rfзначений, полученных для ряда консервантов с использованием TСХ, можно найти в: N. dе Kruijf, М. А.H. Rijk, L. A. Pranato-Soetardhi и А. Schouten (1987): Определение консервантов в косметических продуктах: процедура тонкослойной хроматографии для выявления консервантов в косметической продукции (J. Chomatography 410, 395-411). Определение консервантов в косметической продукции I: процедуры тонкослойной хроматографии для идентификации консервантов в косметической продукции.

7.3. Rfзначения, которые могут быть получены, представлены в ниже приведенной таблице:

Соединение	h Rf	Цвет
4-гидроксибензойная кислота	11	красный
Метилпарабен кислоты	12	красный
Этилпарабен кислоты	17	красный
Пропилпарабены кислоты	21	красный
Бутилпарааминобензойная кислота	26	красный
Бензилпарабен	16	красный
2-феноксиэтанол	29	желтый
1-феноксипропандиол	50	желтый

7.4. Нет разделения для 4-гидроксибензойной кислоты и метилпарабен - или бензилпарабен - и этилпарабеновой кислоты.  Идентификация этих соединений может быть подтверждена путем процедуры ВЭЖХ, описанной ранее в разделе В, и сравнением полученного времени удерживания проб с временем удерживания стандартов.

В. ОПРЕДЕЛЕНИЕ

1. ПРЕДМЕТ И ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ

Этот метод описывает определение 2-феноксиэтанола, 1-феноксипропан-диола, метил-4-гидроксибензоата, этил-4-гидроксибензоата, пропил-4-гидроксибензоата, бутил-4-гидроксибензоата и бензил-4-гидроксибензоата в косметических продуктах.

2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ

Содержание консервантов, определенное данным методом, выражено в процентах массы.

3. ПРИНЦИП

Проба подкисляется серной кислотой и затем суспендируется в смеси этанола и воды. После осторожного нагревания смеси до расплавления липидной фазы и количественной экстракции, смесь профильтровать.

Консерванты из фильтрата определяются инверсионной высокоэффективной жидкостной хроматографией, при использовании изопропил 4-гидроксибензоата в качестве внутреннего стандарта.

4. РЕАГЕНТЫ

4.1. Общие требования.

Все реагенты должны быть аналитической чистоты или подходящие для ВЭЖХ. Вода должна быть дистиллированной или водой по меньшей мере такой же чистоты.

4.2. Этанол, абсолютный.

4.3. 2-Феноксиэтанол.

4.4. 1-Феноксипропандиол.

4.5. Метил-4-гидроксибензоат (метилпарабеновая кислота).

4.6. Этил-4-гидроксибензоат (этилпарабеновая кислота).

4.7. n-Пропил-4-гидроксибензоат (пропилпарабеновая кислота).

4.8. Изопропиловый 4-гидроксибензоат (изопропилпарабен).

4.9. n-Бутил-4-гидроксибензоат (бутилпарааминобензойная  кислота).

4.10. Бензил-4-гидроксибензоат (бензилпарабен).

4.11. Тетрагидрофуран.

4.12. Метанол.

4.13. Ацетонитрил.

4.14. Серная кислота, раствор С (Н 2 SO 4) = 2 моль / л

4.15. Смесь этанол/вода.

Смешать девять объемов этанола (4.2) и один объем воды.

4.16. Внутренний стандартный раствор

Взвесить с точностью 0,001г 0,25 г изопропилпарабена (4.8), перевести в мерную колбу на 500 мл, растворить и довести до метки смесью этанол/ вода (4.15).

4.17. Подвижная фаза: смесь тетрагидрофуран/вода/метанол/ ацетонитрил.

Смешать 5 объемов тетрагидрофурана, 60 объемов воды,  10 объемов метанола и 25 объемов ацетонитрила.

4.18. Стандартный раствор консерванта

В мерной колбе на 100 мл точно взвесить 0,2 г 2-феноксиэтанола, 0,2 г 1-фенокси-2-пропандиола, 0,05г метилпарабеновой кислоты, 0,05г этилпарабеновой кислоты, 0,05г пропилпарабеновой кислоты, 0,05г бутилпарааминобензойной кислоты и 0,025 г бензилпарабена, растворить и довести до метки смесью этанол/вода.

Раствор стабилен в течение одной недели в холодильнике.

4.19. Стандартные растворы консерванта

В набор мерных колб на 50 мл из исходного раствора (4.18) перевести соответственно, 20,00 мл, 10,00 мл, 5,00 мл, 2,00 мл и 1,00 мл. В каждую колбу, добавить по 10,00 мл раствора внутреннего стандарта ( 4.16) и 1,0 мл серной кислоты (4.14) и довести до метки смесью этанол/вода. Растворы должны быть свежеприготовленными.

5. ОБОРУДОВАНИЕ

Стандартное лабораторное оборудование, а также:

5.1. Водяная баня, способная поддерживать температуру 60°С ± 1 ° С

5.2. Хроматограф ВЭЖХ с УФ-детектором, длина волны 280 nm.

5.3. Аналитическая(хроматографическая) колонка:

Нержавеющая сталь, внутренний диаметр 25 см Ч 4,6 мм (или 12,5 см Ч 4,6 мм); наполненная Nucleosil 5C18 или эквивалентом (см. пункт 10.1).

5.4. Стеклянные пробирки на 100 мл с винтовой крышкой.

5.5. Гранулы для гомогенизации кипения, карборундум размером 2 -

4 мм или эквивалент.

6. ПРОЦЕДУРА

6.1. Подготовка пробы.

6.1.1. Подготовка пробы без добавления внутреннего стандарта.

В стеклянной пробирке с винтовой крышкой на 100 мл взвесить 1,0 г ± 0,1 г образца. Пипеткой ввести 1,0 мл серной кислоты (4.14) и 50,0 мл смеси этанол/вода (4.15). Добавить примерно 1 г гранул (5.5). Пробирку закрыть и энергично встряхивать до получения однородной суспензии не менее одной минуты. Поместить пробирку в течение пяти минут на водяную баню (5.1) при 60 ° C ± 1 ° C, чтобы облегчить экстракцию консервантов в спиртовой фазе.

Пробирку немедленно охладить в потоке холодной воды и поместить экстракт в холодильник на один час. Профильтровать экстракт через фильтровальную бумагу. 2 мл фильтрата перевести в флакон для проб на  5мл. Хранить экстракты в холодильнике и провести определение  с  помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии ВЭЖХ в течение 24 часов.

6.1.2. Подготовка проб с добавлением внутреннего стандарта.

В стеклянной пробирке с винтовой крышкой на 100 мл взвесить 1,0 г ± 0,1 г пробы. Пипеткой  добавить 1,0 мл раствора серной кислоты и 40,0 мл смеси этанол/вода. Добавить примерно 1 г гранул (5.5) и точно 10,00 мл раствора внутреннего стандарта. Пробирку закрыть и энергично встряхивать до получения однородной суспензии. Встряхивать не менее одной минуты. Затем на пять минут поместить на водяную баню (5.1) при 60° C ± 1°C, чтобы облегчить экстракцию консервантов в спиртовой фазе.

После этого пробирку немедленно охладить под потоком холодной воды и поместить экстракт в холодильник на один час. Экстракт профильтровать через фильтровальную бумагу. 2 мл фильтрата перевести в флакон для проб на 5 мл. Необходимо хранить экстракты в холодильнике и провести определение с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии ВЭЖХ в течение 24 часов.

6.2. Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ)

6.2.1. Хроматографические условия:

- подвижная фаза: смесь тетрагидрофурана/воды/метанола/ ацетонитрила (4.17);

-  расход: 1,5 мл / мин;

-  детектируемая  длина волны: 280 nm.

6.2.2. Эталонирование

Впрыснуть в хроматограф по 10 µl каждого из стандартных растворов консервантов (4.19). Из полученных хроматограмм определить соотношения между высотами пиков стандартных растворов консервантов и высотой пика внутреннего стандартного раствора. Для каждого консерванта построить калибровочную кривую, выявив соотношение высоты пиков к концентрации стандартных образцов.

6.2.3. Определение.

Впрыснуть в хроматограф 10 мl раствора пробы без внутреннего стандарта (6.1.1) и записать хроматограмму.

Впрыснуть 10 мl из одного из стандартных растворов консервантов (4.19) и записать хроматограмму. Сравнить полученные хроматограммы.

Если на хроматограмме образца (6.1.1) нет никакого пика в то же время удерживания, как и у изопропилпарабена (рекомендуемый внутренний стандарт), продолжить вводить по 10 µl образца раствора с внутренним стандартом (6.1.2). Записать хроматограммы и измерить высоты пиков.

Если на хроматограмме пробы наблюдается пик примерно в то же время удерживания, как и у изопропилпарабена, необходимо выбрать другой внутренний стандарт.

Если один из рассматриваемых консервантов отсутствует на хроматограмме пробы, этот консервант может быть использован в качестве альтернативного внутреннего стандарта.

Рассчитать соотношение высот пиков исследуемых консервантов к высоте пика внутреннего стандарта.

Эталонные кривые стандартных образцов должны быть линейными.

Проверить, если хроматограммы, полученные для стандартного раствора и раствора образца, отвечают следующим требованиям:

Разделение самой плохой пары пиков должна быть, по крайней мере, 0,90.

Для определения пикового разделения см. рис. 1).

Рис.1 Хроматограмма разделения стандартного раствора и пробы

Если требуемое разделение не достигнуто, необходимо использовать более эффективную колонку или подобрать состав подвижной фазы до достижения нужного результата.

Коэффициент асимметрии всех полученных пиков должен находиться в диапазоне от 0,9 до 1,5.

Для определения коэффициента асимметрии пика см. рис.2.

Для определения коэффициента асимметрии рекомендуемая скорость записи хроматограммы должна быть, по крайней мере, 2 см / мин.

Рис. 2 Хроматограмма определения коэффициента асимметрии

- Базовая линия должна быть стабильной

7. РАСЧЕТ

Для расчета концентрации консерванта в растворе пробы используется эталонная кривая (6.2.2) и соотношение между высотами пиков исследуемых консервантов в образцах и высотами пиков внутреннего стандарта. Рассчитать содержание 2-феноксиэтанола, 1-феноксипропандиола, метил-4-гидроксибензоата, этил-4-гидроксибензоата, пропил-4-гидроксибензоата, бутил-4-гидроксибензоата и бензил-4-гидроксибензоата, в процентах массы (% m/m), используя формулу:

.

где:

bi - концентрация (µg/ml) консерванта “i” испытуемого раствора, рассчитанная по эталонной кривой; и

а - масса (г) анализируемой пробы.

8. ПОВТОРЯЕМОСТЬ (1)

См. примечание к пункту 10.5 настоящей главы.

9. ВОСПРОИЗВОДИМОСТЬ (1)

См. примечание к пункту 10.5 настоящей главы.

10.  ПРИМЕЧАНИЕ

10.1. Стационарная фаза

Степень удержания растворенных веществ в определениях, проведенных с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии ВЭЖХ, в значительной степени зависит от типа, качества и состава неподвижной фазы. Можно узнать, если используемая колонка эффективна для разделения исследуемых консервантов по результатам, полученным для стандартных образцов (см. примечание к пункту 6.2.3). Кроме предлагаемой фазы для колонки может быть использована и фаза Hypersil ODS и Zorbax ODS.

Рекомендуемая подвижная фаза также может быть оптимизирована до получения желаемого разделения.

10.2. Детектируемая длина волны

Тест на надежность описанного метода показал, что небольшое изменение в длине волны детектирования может оказать существенное влияние на результаты определения.

Таким образом, этот параметр должен тщательно проверяться в ходе анализа.

10.3. Мешающие вещества.

В условиях, описанных в настоящем методе, многие другие соединения, такие как консерванты и косметические добавки, могут оставаться элюированными. Время удерживания большого количества консервантов, указанных в Приложении VI к Директиве Совета о косметических продуктах, перечислено в: N. dе Kruijf, M. A.H. Rijк, L. A. Pranato-Soetardhi и А. Schouten, (1989). Определение консервантов в косметических продуктах.

II: Высокая производительность, идентификация жидкостной хроматографии (J. Chromatography хроматографии 469, 317-398).

10.4. Для сохранения аналитической колонки можно использовать соответствующую адекватную защитную колонку.

10.5. Этот метод был изучен в качестве теста в девяти сотрудничающих между собой лабораториях. Они проанализировали три пробы. Приведенная ниже таблица показывает для каждой из трех проб, среднее значение в % m/m (m), повторяемость (r) и воспроизводимость (R), установленные в анализируемых веществах:

Образец		2-фенокси-этанол	1-фенокси-пропан диол	Метил-парабен	Этил-парабен	Пропил парабен	Бутил парабен	Бензил парабен
Витаминный крем	m	1,124		0,250	0,0628	0,031	0,0906
r	0016		0,018	0,0035	0,0028	0,0044
R	0,176		0,030	0,0068	0,0111	0,0034
Увлажняющий  крем	m	1,196		0,266	0,076
r	0040		0,003	0,002
R	0,147		0,022	0,004
Крем для массажа	m		0,806			0180	0,148	0,152
r		0,067			0,034	0,013	0,015
R		0,112			0,078	0,012	0,016

(1) ISO 5725.