Тест-система Ристоцетин-кофактор.
Ristocetin Cofactor Assay. Cat. No. 5370
I. Применение
Тест Ристоцетин-кофактор предназначен для количественного определения активности, отражающей активность фактора Виллебранда в плазме1.
Набор Ристоцетин-кофактор измеряет способность плазмы пациента вызывать агглютинацию тромбоцитов, фиксированных формалином, в присутствии ристоцетина. Скорость ристоцетин-индуцируемой агглютинации тромбоцитов зависит от концентрации фактора Виллебранда.
II. Меры предосторожности
Реактивы, содержавшиеся в этом наборе, предназначены только для диагностики in vitro. Не принимать внутрь! При работе с компонентами набора следует надевать перчатки. Ознакомьтесь с инструкцией продукта по мерам предосторожности. Плазменные продукты были проверены на содержание (если другого не указано на упаковке) антигенов к гепатиту B (HBsAg), HIV1,2 и HCV антител c отрицательным результатом, тем не менее, при работе следует обращаться с ними с той же осторожностью, что и с образцами плазмы человека.
Некоторые компоненты набора содержат азид натрия в качестве консерванта. Для предотвращения азидного нароста в свинцовых или медных канализационных трубах смывайте сливаемые в раковину реактивы большим количеством воды и регулярно удаляйте примеси раствором гидроксида натрия.
III. Реактивы
Лиофилизованные тромбоциты. (4х5мл)Флакон содержит фиксированные формалином тромбоциты в Tris-буфере.
Приготовление: растворите содержимое каждого флакона в 5мл Tris-буфера. Аккуратно интенсивно перемешайте круговыми движениями, дайте постоять 20 минут.
Флакон содержит 1мл лиофилизованной нормальной человеческой плазмы, с известной активностью ристоцетин-кофактора.
Приготовление: растворите содержимое каждого флакона в 1мл очищенной воды. Аккуратно интенсивно перемешайте круговыми движениями, дайте постоять 10 минут. Перед применением аккуратно перемешайте. Не трясти.
Tris-буфер. (1х35мл)Флакон содержит 35мл 0.05М Tris и 0.15М хлорида натрия с азидом натрия в качестве консерванта. Tris-буфер уже готов к использованию.
Патологичный контроль ристоцетин кофактора. (2х0.5мл)Флакон содержит 0.5мл лиофилизованной плазмы от донора с болезнью Виллебранда. Значение активности дано во вложенной инструкцию по применению набора.
Приготовление: растворите содержимое каждого флакона в 0.5мл очищенной воды. Аккуратно интенсивно перемешайте круговыми движениями, дайте постоять 10 минут. Перед применением аккуратно перемешайте. Не трясти.
Ристоцетин. (2х1.5мл)Флакон содержит 10 мг/мл ристоцетина, лиофилизованного со стабилизаторами.
Приготовление: растворите содержимое каждого флакона в 1.5мл очищенной воды. Аккуратно интенсивно перемешайте круговыми движениями, дайте постоять 10 минут. Перед применением аккуратно перемешайте. Не трясти.
Другие компоненты набора.Каждый набор содержит инструкцию по применению.
IV. Хранение и стабильность
Запечатанные реактивы устойчивы до указанного срока действия, при соблюдении условий хранения, указанных на упаковке.
Лиофилизованные тромбоциты. Разведенный реактив устойчив в течение 24 часов при температуре хранения 2ч6°C или 30 дней при -20°C. Калибратор SARP. Разведенный реактив устойчив в течение 2 часов при температуре хранения 2ч6°C или 30 дней при -20°C. Tris-буфер. Вскрытый флакон должен храниться при температуре 2ч6°C. Патологичный контроль ристоцетин кофактора. Разведенный реактив устойчив в течение 8 часов при температуре хранения 2ч6°C или 30 дней при -20°C. Ристоцетин. Разведенный реактив устойчив в течение 8 часов при температуре хранения 2ч6°C или 30 дней при -20°C.V. Необходимое, но не поставляемое оснащение
VI. Сбор и приготовление образцов
Следует использовать только пластиковые или силиконизированные стеклянные пробирки. Кровь забирается в пробирку с цитратным антикоагулянтом (3.2% или 3.8% цитрат натрия) в соотношении 9:1. Кровь собирается в вакутейнеры. Соотношение объемов крови и натрия цитрата должно быть 9:1. Натрия цитрат может быть 3.2% или 3.8%. Отцентрифугируйте при 2000-3000g в течение 15минут. Плазма должна храниться при температуре 2ч6°C. Тесты должны проводиться в течение 2 часов с момента сбора или плазму можно хранить при -20°C в течение 2 недель или месяц при -70°C. Быстро разморозить при 37°C. Не хранить при 37°C более чем 5 минут.
VII. Пошаговое руководство
Подготовьте все реактивы в соответствии с прилагаемой инструкцией для каждого реактива. Выставите настройки агрегометра, следуя указаниям инструкции пользователя.
Построение калибровочной кривой.Постройте калибровочную кривую, используя соответствующие разведения (в Tris-буфере), чтобы, по крайней мере, 3 точки кривой находились в интервале 10ч60% активности.
Перемешивайте без встряхивания.
Приготовление образцов пациента.Приготовьте 1+1 и 1+3 разведения плазмы пациента или контрольной плазмы в Tris-буфере. Перемешайте, без встряхивания.
Приготовление холостой пробы для агрегации.В агрегационную кювету с мешалкой поместить 0.25мл суспензии тромбоцитов и 0.25мл Tri-буфера. Это необходимо для установления 100%-го уровня активности.
VIII. Интерпретация результатов
Постройте график зависимости угла наклона агрегационной кривой (ось Y) от активности разведений SARP (ось X) в двойных логарифмических координатах. Аппроксимируйте прямой линией. Интерполируйте угол наклона кривой пациента по графику для нахождения процента активности. Скорректируйте полученные результаты с соответствующим разведением и установленной активностью SARP.
VII. Контроль качества
Каждая лаборатория должна установить программу контроля качества. Рекомендуется проводить один нормальный и патологичный контроль при каждом определении образцов, для гарантии правильности работы анализатора и оператора. Если контроли не укладываются в установленные данной лабораторией пределы, то результаты измерений образцов пациентов нужно считать недействительными.
Патологичный контроль ристоцетин кофактора, поставляемый в наборе, должен использоваться неразведенным и давать результаты, укладывающиеся в обозначенную область.
Компания Хелена предлагает следующие контроли для использования с данным продуктом.
Кат. номер 5301 SAC-1. Кат. номер 5302 SAC-2.XII. Ограничения
Активность кофактора ристоцетина не может точно определить нарушения, связанные с фактором Виллебранда в некоторых случаях, таких как беременность2, введении концентрата фактора VIII3,4, волчаночной терапии5. В таком случае, фактор Виллебранда–ристоцетин-кофактор может быть скорректирован, даже если время кровотечении остается удлиненным. Кроме того, уровень фактора Виллебранда–ристоцетин-кофактора может быть нормальным при заболевании Виллебранда II типа, даже при удлиненном времени кровотечения6.
VIII. Референсные значения
Референсные значения могут варьировать между лабораториями в зависимости от методов и анализаторов, которые используют лаборатории для выполнения данного теста. По этой причине каждой лаборатории необходимо установить свой собственный нормальный диапазон. Ожидаемые значения для активности ристоцетин-кофактора для взрослого населения лежат в диапазоне 58ч166% (0.58ч1.66 ед/мл). Каждой лаборатории настоятельно рекомендуется определить собственную область нормальных значений для конкретных приборов/реактивов при их рутинном использовании.
IX. Аналитические характеристики
Нижеприведенные аналитические характеристики измерений были определены компанией Helena BioSciences или ее представителями как стандартные. Каждая лаборатория должна определить свои собственные значения.
Ристоцетин кофактор производства компании Helena обеспечивает линейность калибровочной кривой в области 10ч60% без предварительного разведения. В пределах одной аналитической серии коэффициент вариации не должен составлять не более 10%.
X. Литература:
Zimmerman, T. S and Ruggeri, Z. M.‘von Willebrands’ Disease’, Progress in Thrombosis and Haemostasis, Spaett (Ed), 1982, 6: 203-236. Ratnoff, O. D. and Bennett, B. ‘Clues to Pathogenesis of Bleeding in von Willebrands’ Disease’, N. Eng. J. Med., 1973, 289 : 1182-1183. Blatt, P. M. et al. ‘Antihemophilic factor Concentrate Therapy in von Willebrands’ Disease’ J. Am. Med. Assn., 1976, 236 : 2770-2772. Green, D. and Potter, E. V., ‘Failure of AHF Concentrate to Control Bleeding in von Willebrands’ Disease’ Am. J. Med., 1976, 60 : 357-360. Mannucci, P. M. et al. ‘Studies on the Prolonged Bleeding Time in von Willebrands’ Disease’, J. Lab. Clin. Med., 1976, 88 : 662-671. Ruggeri, Z. M. et al., ‘Heightened Interaction Between Platelets and Factor VIII/von Willebrand Factor in a New Subtype of von Willebrands’ Disease.’, N. Eng. J. Med., 1980, 302 : 1047-1051.