Предполагаемое использование

ПРЕДПОЛАГАЕМОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ

Данный иммунологический метод направлен на количественное определение in vitro гемоглобина A1c (HbA1c) в крови.

Определение HbA1c  используется при долгосрочном мониторинге сахарного диабета. Этот метод не должен быть использован для диагностики сахарного диабета или ежедневного мониторинга глюкозы.

В некоторых методах причиной ошибочного определения процента HbA1c может быть подвижная фракция гликированного гемоглобина.

Данный метод не чувствителен к присутствию подвижного HbA1c так как использованные антитела специфичны к HbA1c.

№ по каталогу.

HA 3830        

Гемоглобин денатурирующий реактив  3 x 50 ml

Реактив общего гемоглобина                        3 x 28 ml

HbA1c R1: Антитела                        3 x 14 ml

HbA1c R2: Агглютинатор                        3 x 14 ml

Сопутствующие реактивы

HA 3450                

HbA1c Денетурирующий реактив  2 x 50 ml

КЛИНИЧЕСКАЯ ВАЖНОСТЬ

Сахарный диабет – это болезнь сопровождающаяся слабым гликемическим контролем. Многие клинические исследования показали, что осложнения, связанные с диабетом, можно уменьшить путем долгосрочного мониторинга и жесткого контроля уровня глюкозы в крови.

У пациентов-диабетиков, уровень глюкозы которых анормально завышен, уровень HbA1c  также завышен, по причине неферментативного гликирования N-конца в-цепи гемоглобина Ао.

Уровень HbA1c  пропорционален уровню глюкозы в крови и широко применяется как индикатор значения ежедневной концентрации глюкозы  в промежутках времени больших чем 6-8 недель.

По этой причине это долгосрочный индикатор при контроле диабета, тогда как измерение глюкозы в крови – краткосрочный показатель.

ПРИНЦИП МЕТОДА

Измеряются концентрации HbA1c  гемоглобина и общего гемоглобина в крови. Результат – процентное содержание HbA1c  гемоглобина от общего гемоглобина крови. Значения полученные для HbA1c  гемоглобина и общего гемоглобина при использовании этого метода используются для определения отношения HbA1c  гемоглобин/общий гемоглобин  (%HbA1c) и не должны быть использованы по отдельности для диагностических целей

(a)        Пробаподготовка

Первый шаг включает в себя обработку образца крови. Производится лизис эритроцитов и гидролиз гемоглобина под действием протеаз, входящих в Гемоглобин денатурирующий реактив.

(b)        Определение общего гемоглобина(10)

Реактив общего гемоглобина используется для определения концентрации общего гемоглобина. Метод включает в себя превращение всех производных гемоглобина в гематин в щелочной среде неионного детергента (Wolf et al (1984)).

Реакция инициируется добавлением подготовленного образца к Общему реактиву гемоглобина. Результатом является позеленение раствора.  Превращение различных видов гемоглобина в щелочной гематин с одним определенным спектром абсорбции позволяет проводить измерение концентрации общего гемоглобина по конечной точке при длине волны 600 нм.

(c) Определение  HbA1c

Определение HbA1c  основано на методе латексного торможения агглютинации.

Агглютинатор, состоящий из синтетического полимера содержащего множественные копии иммунореактивного сегмента  HbA1c, вызывает агглютинацию латексных частиц, покрытых  HbA1c специфичными моноклональными антителами мыши.

При отсутствии HbA1c в образце, агглютинатор в HbA1c R2 реактиве и микрочастицы покрытые антителами в HbA1c R1 реактиве будут агглютинировать, вызывая увеличение абсорбции.

В присутствии HbA1c  в пробе, уровень агглютинации будет уменьшаться, так как молекулы HbA1c будут конкурировать с агглютинатором за сайты связывания на латексных частицах.

Таким образом, увеличение абсорбции обратно пропорционально концентрации HbA1c в пробе.

Увеличение абсорбции, вызванное агглютинацией, измеряют при длине волны 700 нм. Уровень агглютинации используется для подсчета концентрации HbA1c по калибровочной кривой. Процентное содержание HbA1c затем подсчитывается из полученных значений для общего гемоглобина и HbA1c  выраженных в гр/дл.

Сбор и хранение образцов(11)

В этом методе может быть использована и венозная и капиллярная кровь.

В качестве антикоагулянтов рекомендовано использование ЭДТА или гепарина.

Кровь стаблизированная ЭДТА или гепарином стабильна 6 месяцев при -70°С, 2 недели при +5°С или 1 неделю при +25°С

Замороженные пробы должны быть разморожены при комнатной температуре, перемешаны перед использованием и не должны быть перезаморожены.

Внимание. Все пробы крови должны быть перемешаны непосредственно перед измерением.

Стабильность подготовленных проб

Подготовленные пробы могут храниться до 8 часов при комнатной температуре или до 48 часов при +2-8°С в закрытом контейнере.

При хранение лизированные пробы могут выпасть в осадок. Рекомендуется перемешивать все пробы непосредственно перед анализом.

Если требуется оставить пробы на ночь, рекомендовано оставлять их при +2-8°С

Состав реактивов

Гемоглобин денатурирующий реактив

Свиной пепсин

Буфер

Консервант

pH 2.4

Реактив общего гемогловина

Натрия гидроксид        0.4% w/v

Тритон        2.5% w/v

Оскилфеноксиполиэтоксиетанол        2.5% w/v

pH 13

HbA1c  R1 : Анттела

Частицы покрытые HbA1c антителами (мышь)        <0.1% w/v

Бычий сывороточный альбумин

Буфер

Неионные ПАВ        0.6% w/v

Проклин 150        0.1% w/v

pH 8.1

HbA1c R2 : Агглютинатор

HbA1c гаптен ковалентно пришитый к полимеру

Бычий сывороточный альбумин

Буфер

Проклин 150        0.1% w/v

Неионные ПАВ        0.2% w/v

pH 2.0

Меры предосторожности

Только для in vitro диагностики. Не пипетировать ртом. Соблюдайте обычные меры предосторожности, принятые в лаборатории.

Реактив общего гемоглобина содержит гидроксид натрия, который является едким веществом. В случае попадения на открытые участки кожи промыть пораженные участки кожи большим количеством воды и обратиться за квалифицированной медицинской помощью.

Реактивы должны быть использованы только квалифицированным лабораторным персоналом при соблюдении условий техники безопасности.

Стабильность и приготовление реактивов

Все реактивы стабильны до истечения срока годности в поставляемом виде при +2-8°С. Хранить в защищенном от света месте и избегать резких перегревов и переохлаждений.

Реактивы должны быть перемешаны и доведены до температуры анализатора примерно за Ѕ  часа до измерения. Реактивы стабильны в течении 30 дней на борту анализатора при +10°С 

Определение общего гемоглобина

Реактив 1 = Реактив общего гемоглобина

Определение HbA1c гемоглобина

Реактив 1 = HbA1c R1 : Антитела

Реактив 2 = HbA1c R2 : Агглютинатор

Процедура теста

Поставляемые материалы

Гемоглобин денатурирующий реактив 

Реактив общего гемоглобина                        

HbA1c R1: Антитела                        

HbA1c R2: Агглютинатор        

Материалы требуемые, но не поставляемые

HbA1c Калибратор, Cat. No.                        HA 3444

HbA1c Контроль качества, Cat. No.                HA 3445

HbA1c  Денатурирующий реактив                HA 3450

Пробаподготовка

Смешать 10 мl крови с 400 мl гемоглобин денатурирующего реактива (разведение 1:41)

Избегайте вспенивания.

Инкубируйте 5 минут при комнатной температуре перед измерением.

Подготовленные пробы могут храниться до 8 часов при комнатной температуре или до 48 часов при +2-8єС в закрытом контейнере.

Процедура определения HbA1c гемоглобина

Длина волны:        600нм

Кювета:        световой путь - 1 cm

температура:        37°C

Измерение:        против воздуха

Пипетировать в пробирки для теста:

        Микро  Полумикро

Стандарт

или проба         120 мl                 40 мl        

Реактив 1  1.5 ml                 500 мl

Перемешать и инкубировать 5 мин при 37°C. Затем добавить:‑

               

                Микро  Полумикро

Реактив         2  1.5 ml                 500 мl

Перемешать и инкубировать 20 секунд при 37°C, произвести первое чтение A1. Инкубировать 120 секунд и снять второе чтение A2. 

Стандартная кивая и обсчет результатов

Aстандарт/проба  =  A2 - A1 (стандарта/пробы)

График  Aстандарт против концентрации HbA1c, приведен во вкладыше к Калибратору, используя полулогарифмическую бумагу для графиков. Концентрация пробы снимается с калибровочной кривой. Не экстраполировать за пределы диапазона значений стандартов.

Процедура определения общего гемоглобина

Длина волны:        600нм

Кювета:        световой путь - 1 cm

температура:        37°C

Измерение:        против реактивного бланка

Пипетировать в пробирки для теста:

               Микро        Полумикро

        Стандарт  Реактив         Стандарт  Реактив

               или проба        Бланк        или проба        Бланк

Стандарт

или проба        200 мl        ‑‑‑        75 мl        ‑‑‑

Дистилли-

рованная

вода        ‑‑‑        200 мl        ‑‑‑        75 мl

Реактив        3.00 ml        3.00 ml        1.00 ml        1.00 ml

Перемешать и инкубировать 5 мин при 37°C.  Затем снять измерение A. 

Подсчет результатов

Общий  Апробы 

гемоглобин (гр/дл)  =  Х концентрация

       Aстандарта  стандарта

       

Калибровка

HbA1c гемоглобин

Мы рекомендуем использовать Randox HbA1c Калибровочные Серии, уровни 1 – 6, для калибровки этого метода. Для получения калибровочной кривой воспользуйтесь значениями концентраций калибратора.

Общий гемоглобин

Мы рекомендуем использовать 0.9% NaCl в качестве бланка и Randox HbA1c Калибровочные Серии, только 1 уровень, для калибровки этого метода.

Многоточечная калибровка рекомендована для HbA1c каждые 30 дней, со сменой лота/бутылки реактива.

Внимание.  Калибратор НЕ ТРЕБУЕТ пробоподготовки.

Калибраторы проверены с помощью метода ВЭЖХ для HbA1c и методом Драбкина для общего гемоглобина.

Контроль качества

Randox HbA1c контроли, Уровень 1 и Уровень 2 рекомендованы для ежедневного контроля качества. Оба уровня контроля должны проводиться как минимум раз в день. Полученные результаты должны попадать в заданный диапазон. В случае если значения не попадают в диапазон и подобная ошибка возникает не однократно, следующие шаги должны быть предприняты:

1. Проверьте настройки анализатора и источник света.

2. Проверьте чистоту используемого оборудования.

3. Проверьте воду на предмет загрязнений (рост бактерий и т. д.)

4.  Проверьте температуру реакции.

5. Проверьте сроки годности реактивов, калибраторов и контрольных материалов.

6. Обратитесь в отдел технической поддержки  Randox Laboratories, Northern Ireland [phone]

Внимание: Контрольные материалы ТРЕБУЮТ пробоподготовки после разведения.

Подсчет

Подсчет концентрации гемоглобина A1c  производится с использованием следующего отношения:

Процентное содержание гемоглобина A1c

       % HbA1c =        HbA1c (гр/дл)  x 100

                               Общ. Hb (гр/дл)

Ожидаемые значения (6, 12-14)

Каждая лаборатория должна составить свои таблицы нормальных значений в зависимости от возраста, пола и национальности пациентов.

В зависимости от используемого метода гемоглобин  A1c составляет 4-6% при отсутствии диабета, 6-8% в случае контролируемого диабета и может быть больше чем 20% в случае неконтролируемого диабета.

1024 практически здоровых мужчин и женщин попадающих под категорию «Норма» были тестированы на гемоглобин А1С этим методом. Ожидаемые значения лежат в диапазоне от 4.5% до 6.2%.

Интерпретация результатов (15)

Метод дает точные и аккуратные результаты по общему гемоглобину в диапазоне от 7 до 23 гр/дл. Пациенты с тяжелыми анемиями (общий гемоглобин < 7гр/дл) и с политемией (общий гемоглобин > 23гр/дл) не должны обследоваться с применением этого метода.

Любые случаи уменьшения время жизни эритроцитов, такие как гемолитическая анемия, другие гемолитические болезни, беременность и т. д. ведут к уменьшению % гликированного гемоглобина.

Пробы, содержащие гемоглобин S и С, могут иметь значения гемоглобина А1С более чем на 40% превышающие ожидаемые.

Так же, пробы, содержащие гемоглобин F (>10%), могут иметь значения гемоглобина А1С меньше ожидаемых.

Таким образом, пробы содержащие гемоглобины S, C и F (>10%) не следует сравнивать с опубликованными нормальными значениями

Пробы, содержащие гемоглобин Е,  не показали расхождений с нормальными значениями.

Влияющая вещество        Концентрация до которой

  влияние на обнаружено.

Билирубин        :        513 мmol/l (30 mg/dl)

Триглицериды        :        18 mmol/l (1600 mg/dl)

Ревматоидный фактор        :        2000 IU/ml

Ацетилсалициловая к-та        :        60 mg/dl

Натрия цианат        :        50 mg/dl

Мочевина        :        83 mmol/l (500 mg/dl)

Подвижная фракция гликированного гемоглобина не оказывает влияния, так как используемые антитела являются специфичными к стабильному кетамину.

Аналитический интервал

Для общего гемоглобина интервал составляет от 7 гр/дл до 23 гр/дл.

Для процентного содержания гемоглобина А1С это концентрации соответствующие уровням калибратора (2,06 гр/дл HbA1c, 14.7% HbA1c при концентрации общего гемоглобина 14 гр/дл).)

Пробы с концентрацией больше 14,7% HbA1c недолжны разводиться и результаты следует представлять, как  >14.7% HbA1c.

Пределы метода (только HbA1c)

Интервал для данного метода примерно 0.3 - 2.06 гр/дл.

Эти данные зависят от лотспецифичных значений использованного калибратора.

Линейность (только для общего гемоглобина)

Метод определения общего гемоглобина линеен до 23гр/дл.