Рекомбинантный аденовирус птиц CELO-ANG, несущий ген ангиогенина человека, индуцирует неоваскуляризацию в передней большеберцовой мышце крысы

Рекомбинантный аденовирус птиц CELO-ANG, несущий ген ангиогенина человека, индуцирует неоваскуляризацию в передней большеберцовой мышце крысы

, , ,

Регуляция роста кровеносных сосудов - одна из наиболее важных задач современной медицины. Новые экспериментальные стратегии для лечения ишемических заболеваний основаны на использовании различных факторов роста кровеносных сосудов, таких, в первую очередь, как VEGF (васкулярный эндотелиальный ростовой фактор), FGF-2 (ростовой фактор фибробластов-2) и других, способных вызывать неоваскуляризацию/ангиогенез in vivo [18, 24, 27]. Повысить уровень ангиогенных белков в организме и поддерживать его длительный период времени в перспективе возможно методами генной терапии гена [22]. В качестве средства доставки гена, кодирующего синтез необходимого белка в организме, при генно-терапевтическом подходе широко используются аденовирусные векторы [16, 20]. В настоящее время  проходит первую фазу клинических испытаний рекомбинантный вектор на основе генома Ad5 человека, являющийся репликационно дефектным и содержащий в месте делеции ранней Е1 области ген, кодирующий VEGF121 человека [21,23]. Однако использование VEGF в качестве индуктора роста кровеносных сосудов может приводить к возникновению негативных для организма побочных явлений, таких как отеки в мышцах [28]. Кроме того, показано, что VEGF стимулирует рост только капилляров, не вызывая увеличения числа более крупных сосудов и коллатералей [12].

В данном исследовании для индукции неоваскуляризации in vivo нами был использован ген ангиогенина человека. Кодируемый этим геном секретируемый белок ангиогенин (ANG) впервые выделен в 1985 году и получил свое название за способность индуцировать рост новых кровеносных сосудов в хорио-аллантоисной мембране куриных эмбрионов [9]. ANG продуцируется различными типами клеток и присутствует в нормальной человеческой плазме [19, 25]. Этот белок способствует миграции эндотелиальных клеток [17], связывается с ними [6], опосредует клеточное сцепление [26], способствует формированию трубчатых структур [8] и может влиять на созревание сосудов, индуцируя пролиферацию гладкомышечных клеток и фибробластов [10].

В качестве вектора для доставки гена ангиогенина в клетки мышечной ткани мы использовали аденовирус птиц CELO (FAV-1), не способный к репликации в клетках млекопитающих. Важным преимуществом данной векторной системы является отсутствие предсуществующего в результате перенесенной инфекции иммунитета  в организме человека и млекопитающих. Кроме того, рекомбинантные вирусы CELO можно наращивать в SPF куриных эмбрионах в препаративных количествах [5], что весьма экономично по сравнению с аденовирусами человека.

Цель настоящей работы заключалась в изучении способности рекомбинантных аденовирусов птиц CELO, несущих в своем составе репортерные гены и ген ангиогенина человека, обеспечивать в мышцах крыс синтез соответствующих белков, а в случае ангиогенина - индуцировать неоваскуляризацию.

Материалы и методы

Рекомбинантные аденовирусы CELO.

В работе использовали ранее полученные аденовирусные векторы CELO-GFP [5] и CELO-SEAP [3], содержащие репортерные гены GFP (кодирует зеленый флуоресцирующий белок) и SEAP (кодирует термостабильную щелочную фосфатазу) под промотором ранней области цитомегаловируса (CMV) в сайте несущественной делеции генома CELO (рис. 1 а, б).

Для получения рекомбинантного аденовируса птиц CELO-ANG (рис. 1 в) применили метод гомологичной рекомбинации в культуре клеток  [3, 5]. Клетки LMH (гепатома петуха легорна) были котрансфецированы плазмидой pS415Ang [1] и геномной ДНК вируса CELO, гидролизованной рестриктазой SwaI. Плазмида pS415Ang содержала область генома вируса CELO от 88,8 до 100 ед. к. и экспрессирующую кассету (промотор ранней области цитомегаловируса, ген ангиогенина, сигнал полиаденилирования гена гормона роста быка) в сайте несущественной делеции [1, 5]. Рекомбинантная плазмида pS415Ang была получена путем клонирования гена ангиогенина из плазмиды pAng3 [2, 4] в плазмиду p415DL[3]. Анализ рекомбинантной ДНК, ее наращивание и очистку осуществляли по методике, описанной и др. [5].

Введение рекомбинантных вирусов в мышечные клетки. Препараты рекомбинантных вирусов CELO-GFP, CELO-SEAP и CELO-ANG, очищенные ультрацентрифегированием в градиенте плотности CsCl, диализовали в буфере PBS (100 mМ KCl, 15 mM KH2PO4, 6,6 mM K2HPO4) в течение 1 часа и инъецировали крысам линии Wistar в переднюю большеберцовую мышцу (M. tibialis anterior) в дозе 109 бляшкообразующих единиц (БОЕ) на инъекцию в объеме 50 мкл.

Детекция экспрессии генов GFP и SEAP.

Для детекции экспрессии гена GFP срезы мышцы крысы исследовали в люминисцентном микроскопе при длине волны 490 нм. Уровень активности SEAP определяли колориметрически при длине волны 405 нм по скорости конверсии п-нитрофенилфосфата. 1 ед. активности соответствует конверсии 1 пмоль п-нитрофенилфосфата, что эквивалентно изменению оптической плотности на 0,04 за 1 мин. Аликвоты сыворотки крови (20 мкл) перед определением активности SEAP прогревали при температуре 65єС в течение 5 мин для ингибирования эндогенной фосфатазной активности [7].

Детекция экспрессии гена ангиогенина методом Вестерн-блоттинга (иммунореплика).

После заражения клеток LMH рекомбинантным вирусом CELO-ANG их инкубировали 48 часов в среде DMEM (“Sigma”). Для анализа ангиогенина были использованы аликвоты зараженных клеток и культуральной среды, в которой они инкубировались. В качестве отрицательного контроля использовали аликвоты культуральной среды и клеток LMH, зараженных рекомбинантным вирусом CELO-SEAP. Клетки отмывали 3 раза охлажденным буфером PBS, затем центрифугировали 1 мин при 3000 об/мин. К осадку добавляли 100 мкл RIPA-буфера (0,05 M Tris-HCl, pH 7,2, 0,15 M NaCl, 0,1% SDS, 1% дезоксихолата Na, 1% Triton X-100), содержащего 1 мМ PNSF и 1мМ ДТТ. Клетки качали во льду на шейкере в течение 60 мин и центрифугировали 20 мин при 12 000 об/мин. Супернатант (внутрицитоплазматические фракции белков клеток) отбирали на анализ. Клеточные белки и белки культуральной жидкости разделяли методом электрофореза в 10%-ом полиакриламидном геле с SDS [14]. После этого осуществляли полусухой перенос [13] на мембрану PVDF («Amersham») (в течение 1 часа при 150 мА) с последующей обработкой ее моноклональными антителами к ангиогенину человека (А-9850 «Sigma») в разведении 1:100 и антивидовым пероксидазным коньюгатом («Sigma») в разведении 1:5000 на буфере 0,02 М PBS-твин 20 (pH 7,2). По окончании переноса мембрану инкубировали в 3% растворе сухого молока («BioRad») на 0,02 М PBS-Твин 20 (0,05% раствор). После каждой стадии инкубации мембрану отмывали трижды водой и трижды 0,05% раствором Твин 20. Выявление комплекса антиген-антитело проводили с использованием ECL plus Western Blotting Detection System («Amersham») согласно протоколу.

Животные и хирургические процедуры. Самцам крыс линии Wistar делали разрез кожи в проекции передней большеберцовой мышцы левой задней конечности. Обезболивание проводили путем введения терапевтической дозы тиопентала натрия внутрибрюшинно. Внутримышечные инъекции проводили в 4 точки передней большеберцовой мышцы в суммарной дозе 109 БОЕ в объеме 50 мкл (см. выше). Животных из эксперимента выводили путем введения летальной дозы тиопентала натрия внутрибрюшинно.

Схема опыта по индукции неоваскуляризации в мышцах крыс.25 крыс разделили на 3 группы. Первой группе проводили инъекции буфера PBS в переднюю большеберцовую мышцу (5 животных). Второй группе в аналогичную мышцу вводили рекомбинантный вирус CELO-SEAP (10 животных), а третьей - CELO-ANG (10 животных). Инъекции проводили на 1, 4 и 7 дни эксперимента. На 14-ый день после первой инъекции по 5 животных из каждой группы было выведено из эксперимента, остальным крысам из 2-ой и 3-ей групп была сделана дополнительная инъекция соответствующих препаратов. Этих животных вывели из эксперимента на 28-ой день.

Гистологический анализ. Препараты мышцы фиксировали в 10% растворе формалина, затем заключали в парафин. Срезы препарата окрашивали азокармином по Гейденгайну. Из исследуемой мышцы от каждой крысы получали 3 блока. Из каждого блока делали 3 среза и считали капилляры в 30 полях окулярной квадратной сетки. В каждой из исследуемых групп (10 крыс в каждой группе) при увеличении Ч280 проводился непосредственный подсчет количества капилляров в 300 полях зрения окулярной квадратной сетки. Полученные данные обрабатывались методом вариационной статистики с использование критерия Стьюдента.

Результаты и обсуждение

Введение репортерных генов GFP и SEAP в клетки мышцы крысы при помощи рекомбинантных аденовирусов. Переднюю большеберцовую мышцу крыс линии Wistar однократно инъецировали вирусом CELO-GFP (рис 1а), контрольным животным был введен буфер PBS. На 3-ий день после инъекции срезы мышцы исследовали в люминесцентном микроскопе и в видимом свете. В клетках мышц животных, инъецированных рекомбинантным вирусом, при исследовании в люминесцентном микроскопе при длине волны 490 нм наблюдалась характерная для GFP флуоресценция (зеленое свечение). В клетках мышц животных контрольной группы такое свечение полностью отсутствовало.

Активность SEAP в сыворотке крови крыс была максимальна на 3 день после однократной инъекции рекомбинантного аденовируса CELO-SEAP в мышцу, постепенно уменьшаясь до 7 дня. В качестве контроля использовалась сыворотка крови крыс, инъецированных вирусом CELO-GFP. Активность SEAP на 3-ий день после инъекции составляла 0,825 мЕд/мл в опытной группе и 0,165 мЕд/мл в контрольной. Таким образом, используя вирусы CELO-GFP и CELO-SEAP, мы показали способность векторов на основе аденовируса птиц CELO осуществлять доставку генов в клетки мышечной ткани и возможность экспрессии этих генов под контролем регуляторных элементов CMV.

Получение рекомбинантного вируса CELO-ANG. Прежде чем приступить к конструированию вируса нами была показана биологическая активность гена ANG в составе плазмиды pS415Ang, по способности индуцировать ангиогенез в хорио-аллантоисной мембране куриных эмбрионов [1]. Данная плазмидная конструкция была использована для получения вируса CELO-ANG методом гомологичной рекомбинации в культуре клеток LMH [3, 5] (см. Материалы и методы). Полученный рекомбинантный аденовирус содержал в правой части генома экспрессирующую кассету, состоящую из промотора ранней области цитомегаловируса, гена ангиогенина и сигнала полиаденилирования гена бычьего гормона роста (рис 1 в).

Экспрессия гена ангиогенина в культуре клеток LMH, зараженных CELO-ANG.

Определение экспрессии ангиогенина в культуре клеток LMH, зараженных CELO-ANG, проводили с помошью метода Вестерн-блоттинга с использованием моноклональных антител к ангиогенину человека. Для этого линия клеток LMH была трансдуцирована рекомбинантным аденовирусом CELO-ANG в дозе 10 БОЕ/клетку. Затем через 48 часов отбирали аликвоты культуральной среды и клеток. В качестве отрицательного контроля использовали аликвоты культуральной среды и клеток, зараженных вирусом CELO-SEAP. По данным анализа рекомбинантный ангиогенин детектировался как в клетках LMH, так и в культуральной среде (рис. 2). Таким образом, нами была продемонстрирована экспрессия гена ангиогенина, находящегося в составе рекомбинантного вируса CELO-ANG, и способность ангиогенина секретироваться во внеклеточное пространство.

Индукция неоваскуляризации в мышцах крыс после введения CELO-ANG лабораторным животным.

Рекомбинантный аденовирус CELO-ANG был инъецирован крысам линии Wistar в переднюю большеберцовую мышцу. В качестве контроля другой группе мышей проводили инъекцию рекомбинантного аденовируса CELO-SEAP, несущего ген секретируемого белка термостабильной щелочной фосфатазы. Подсчет сосудов проводили вне зоны продуктивного воспаления в 300 полях окулярной квадратной сетки для каждой группы. На рис. 3 приведена типичная картина, наблюдаемая при анализе срезов под микроскопом. Видно преобладание количества кровеносных сосудов в одном из участков поля окулярной квадратной сетки среза из мыщцы, инъецированной вирусом CELO-ANG, над количеством капилляров на аналогичном участке из мышцы, инъецированной CELO-SEAP. Прирост кровеносных сосудов оценивали по отношению количества капилляров в срезах мышц мышей из групп, инъецированных вирусами к количеству капилляров в срезах мышц мышей из второй контрольной группы, которой был введен буфер PBS. Гистологический анализ показал, что вирус CELO-ANG вызвал заметный прирост кровеносных сосудов в M. tibialis anterior по сравнению с обеими контрольными группами животных (табл. 1). Прирост капилляров после введения вируса с геном ангиогенина по сравнению с вирусом, содержащим ген SEAP, статистически достоверен (p<0,01) (табл. 1).

Однако, нельзя не обратить внимание на прирост капилляров в мышцах крыс, инъецированных CELO-SEAP, по сравнению с группой, инъецированной PBS. Данный эффект прироста соcудов можно объяснить тем, что введенный вирус сам по себе является агентом, индуцирующим иммунный ответ, который сопровождается вовлечением факторов роста кровеносных сосудов [12], что может вызвать их прирост после введения вирусного вектора с репортерным геном. Нельзя исключить и эффект действия белка щелочной фосфатазы, который также может вызывать определенный ответ иммунной системы организма.

Таким образом, сконструированный нами рекомбинантный аденовирус птиц CELO-ANG проявлял статистически достоверный ангиогенный эффект in vivo. К сожалению, векторная система на основе вируса CELO еще не достаточно разработана для практического использования в медицине. В частности, в геноме CELO не инактивирована область GAM-1, экспрессирующая факторы, регулирующие транскрипцию генов в клетках кур [15]. Можно ожидать, что векторная конструкция на основе ДНК аденовируса птиц CELO после соответствующей модификации окажется эффективной для использования в генной терапии, в частности в терапии ишимизированных конечностей у человека.

Список литературы

, , и др.// Мол. генетика, микробиол., вирусол.-2003-. 32-35. , , «Рекомбинантная плазмидная ДНК (варианты), способ индукции ангиогенеза, способ лечения ишемической болезни и композиции для лечения ишемической болезни», патент N 2209245 от 01.01.01 г.. , , и др.// Мол. генетика, микробиол., вирусол.-2002-. 24-29. , ,. и др.// Биотехнология-2001- . 85-93. , , и др.// Мол. генетика, микробиол., вирусол.-2002-. 30-35. Badet J., Soncin F., Guitton J. D. et al.// Proc Natl Acad Sci U S A.-1989-Vol. 86-P. 8427-8431. Berger J. Hauber J., Hauber R. et al.// Gene.-1988-Vol. 66-P. 1-10. Chamoux M., Dehouck M. P., Fruchart J. C. et al.// Biochem. Biophys. mun.-1991-Vol. 176-P. 833-9. Fett J. W., Strydom D. J., Lobb R. R. et al.// Biochemistry.-1985-Vol. 24-P. 5480-6. Heath WF Jr, Moore F, Bicknell R et al.// Proc Natl Acad Sci U S A.-1989-Vol. 86-P. 2718-2722. Hershey JC, Baskin EP, Corcoran HA et al.// Heart Vessels.-2003-Vol. 18-P. 142-149. Hooper L. V., Stappenbeck T. S., Hong C. V., Gordon J. I.// Nat. Immunol.-2003-Vol. 4-P. 269-273. Kuhse-Andersen J.// J Biophys Biochem Methods-1984-Vol. 10-P.203-209. Laemmli U. K.// Nature.-1970-Vol. 227-P. 680-685. Lehrmann H, Cotten M. // J. Virol.-1999-Vol. 73-P. 6517-6525. Lubiatowski P, Gurunluoglu R, Goldman CK et al.// Plast Reconstr Surg.-2002-Vol. 110-P. 149-159. Lyons RM, Gentry LE, Purchio AF et al.// J Cell Biol.-1990-Vol. 110-P. 1361-1367. Masaki I, Yonemitsu Y, Yamashita A, et al.// Circ Res.-2002-Vol. 17-P. 966-973. Moenner M, Gusse M, Hatzi E et al.// Eur J Biochem.-1994-Vol. 226-P. 483-490. Muhlhauser J, Merrill MJ, Pili R et al.// Circ Res.-1995-Vol. 77-P. 1077-86. Rajagopalan S, Trachtenberg J, Mohler E et al.// Am J Cardiol.-2002-Vol. 90-P. 512-516. Rasmussen HS, Rasmussen CS, Macko J et al.// Curr Opin Mol Ther.-2002-Vol. 4-P. 476-481. Rosengart TK, Lee LY, Patel SR et al.// Circulation.-1999-Vol. 100-P. 468-474. Rosengart T. K., Patel S. R., Crystal R. G. // J. Cardiovasc. Risk.-1999-Vol. 6-P. 29-40. Shapiro R., Strydom D. J., Olson K. A. et al.// Biochemistry.-1987-Vol. 26-P. 5141-5146. Soncin F. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1992-Vol. 89-P. 2232-2236. Tomanek RJ, Holifield JS, Reiter RS et al.// Dev. Dyn. .-2002-Vol. 225-P. 233-240. Vajanto I., Rissanen T. T., Rutanen J. et al.// J. Gene. Med.-2002-Vol. 4-P. 371-380.

Подписи к рисункам

Рис. 1. Структурная организация геномов рекомбинантных аденовирусов птиц CELO GFP (а), CELO SEAP (б) и CELO ANG (в), содержащих гены зеленого флюоресцирующего белка, секретируемой щелочной фосфатазы и ангиогенина человека, соответственно. CMV – промотор ранней области цитомегаловируса человека; pA – сигнал полиаденилирования гормона роста быка; ANG – ген ангиогенина человека; е. к. – единицы физической карты (1 ед. карты соответствует 359 п. н.).

Рис. 2. Иммунореплика детекции экспрессии рекомбинантного ангиогенина человека в культуральной жидкости и клетках линии LMH, инфицированных рекомбинантными вирусами.

Дорожка 1 - препарат белков культуральной жидкости (клетки LMH заражены вирусом CELO-ANG), дорожка 2 - препарат белков культуральной жидкости (клетки LMH заражены вирусом CELO - SEAP), дорожка 3 - препарат внутриклеточных белков (клетки LMH заражены вирусом CELO-ANG), дорожка 4 - препарат внутриклеточных белков (клетки LMH заражены вирусом CELO - SEAP).

Рис. 3. Гистологические срезы передней большеберцовой мышцы крыс, инъецированных рекомбинантными аденовирусами CELO-SEAP (А) и CELO-ANG (Б).

Срезы окрашены азокармином. Подсчет количества кровеносных сосудов проводили при увеличении Ч280.

Таблица 1. Количество капилляров на срезах мышц крыс, инъецированных рекомбинантными вирусами и буфером.

Инъецированный вирус или буфер	CELO-SEAP	CELO-ANG	Буфер PBS
День эксперимента	14	28	14	28	28
Количество животных	5	5	5	5	5
Среднее количе-ство капилляров в поле окулярной сетки (P<0,01)	27,85±0,8	30,08±0,8	33,03±0,7	34±0,9	21,54±0,6