Биоконверсия надземной части топинамбура

Публикация доступна для обсуждения в рамках функционирования постоянно действующей

интернет-конференции “Химические основы рационального использования возобновляемых природных ресурсов”. http:///natural_resources/

Поступила в редакцию 22 марта 2016 г. УДК 577.112.083+577.152.321.

Тематическое направление: Биоконверсия фитомассы Helianthus tuberosus L (топинамбур)

в сахара для производства биотоплива. Часть 2.

Биоконверсия надземной части топинамбура

©

Лаборатория биохимии и биотехнологии. Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Институт биологии Коми научного центра УрО РАН. Ул. Коммунистическая, 28. г. Сыктывкар, 167982. Республика Коми. Россия. Тел.: [phone]. E-mail: *****@***komisc. ru

Ключевые слова: стебли топинамбура, ферментативный гидролиз, мультиэнзимные композиции, биотопливо.

Аннотация

Проведена оценка культуры Helianthus tuberosus L (топинамбур) как потенциального биотех-нологического объекта для биоконверсии в сбраживаемые производные с целью получения биотоп-лива. Дана сравнительная характеристика реакционной способности биомассы стеблей и клубней топинамбура при гидролизе ферментными комплексами с разной субстратной специфичностью. Установлен оптимальный состав композиции ферментных комплексов для гидролиза биомассы стеблей и жмыха топинамбура после отбора сока для выделения инулина. Показана возможность гидролиза смешанных субстратов клубни-стебли и жмых-стебли с помощью трехкомпонентной композиции на основе целлюло-, пектино - и амилолитических ферментных препаратов.

Введение

В процессе роста топинамбур образует мощную надземную часть: его стебли могут достигать высоты в 2-3 метра, при этом выход зеленой массы топинамбура по весу равен или превышает урожай клубней в 1.5 раза. Углеводы составляют значительную часть от общего содержания сухих веществ как в листьях, так и в стеблях. Согласно [1] в листьях содержатся моно-, олигосахариды и крахмал. Инулин в листьях отсутствует и обнаруживается в неболь-ших количествах в нижней части стеблей. В зависимости от сезона и стадии роста содержание моносахаридов может изменяться в пределах 2.54-2.62%, ди - и олигосахаридов 1.44-13.25%, крахмала 0.67-2.44% от сухого веса зеленой массы. Структурные полисахариды клеточных стенок представлены целлюлозой, гемицеллюлозами и пектином. Их суммарное содержание в листья составляет 17-19%, в стеблях 25-29% от сухого веса. [2]. Зеленая масса топинамбура по своим кормовым качествам приближается к луговому сену и может использоваться для получения силоса на корм скоту.

Целью работы являлась оценка целесообразности использования зеленой массы топи-намбура для биоконверсии в сбраживаемые производные при производстве биотоплива, а также определение оптимального состава мультиэнзимных композиций для ее фермента-тивного гидролиза.

Экспериментальная часть

В работе использовалась надземная часть (стебли и листья) топинамбура сорта «Белый ранний», выращенного на опытном участке Института биологии Коми НЦ УрО РАН (Республика Коми, г. Сык-тывкар). Стебли измельчали на рубительной машине без отделения от листьев и хранили в замо-роженном состоянии. Перед ферментативным гидролизом (ФГ) зеленую массу дополнительно измель-чали на шнековой мельнице с ручным приводом до размеров частиц 1-3 мм. Перед обработкой определяли влажность и содержание абсолютно сухого вещества (а. с.в.) в образцах путем их высуши-вания при 105 °С до постоянного веса.

Определение содержания редуцирующих сахаров (РС) в пересчете на глюкозу проводили после водной экстракции образцов зеленой массы в течение 1 часа, при температуре 80 oС в термостати-рованном реакторе при перемешивании на магнитной мешалке. Проэкстрагированную массу отфильт-ровывали под вакуумом водоструйного насоса и промывали дистиллированной водой на фильтре. Промывные воды объединяли с основным фильтратом и определяли общий объем экстракта.

Ферментативный гидролиз зеленой массы топинамбура проводили в тех же условиях, что и гидролиз клубней [3]. Однако, учитывая более высокое содержание целлюлозы и пектина в стеблях и листьях, а также наличие в них лигнина, концентрацию ферментных препаратов (ФП) в реакционной смеси увеличили в 2 раза – до 3.0 мг/мл.

Содержание РС в пробах гидролизатов определяли по методу Сомоджи-Нельсона [4, 5]. Содер-жание белка в растворах ФП определяли по модифицированному методу Лоури [6].

Начальную скорость реакции гидролиза Vн (мг/мин) рассчитывали по формуле 1:

Vн = (Q1 - Q0) / 60,                                        (1)

где Q1 – количество РС в смеси через 1 час, мг; Q0 – исходное количество РС, мг.

Приведенную скорость реакции гидролиза Vпр (мг/мин×мг белка) рассчитывали по формуле 2:

Vпр = Vн / Qбелка,                                        (2)

где Qбелка – количество белка, добавленного в смесь с ФП, мг.

Степень конверсии биомассы S (%) рассчитывали по формуле 3:

S = (Mн - Mк)×100% / Mн,                                (3)

где Mн – масса а. с.в. в исходном образце, г; Mк – масса а. с.в. в негидролизуемом остатке, г.

Результаты и их обсуждение

Для оценки реакционной способности (гидролизуемости) зеленой массы топинамбура была проведена ее обработка ферментными препаратами с разной субстратной специфич-ностью. Непосредственно перед ферментативным гидролизом измельченную  зеленую массу подвергали водной экстракции (ВЭ) при температуре 80 °С в течение 1 часа для удаления свободных РС. Содержание РС в стеблях, определенное по результатам ВЭ оказалось выше, чем в свежих клубнях [3] и составляло от 6.4 до 9.7 % от а. с.в.

В табл. 1 приведены результаты гидролиза стеблей топинамбура с помощью целлюлоли-тического (Целловиридин Г20х), пектинолитического (Пектофоетидин Г20х), амилолитичес-кого (Глюкаваморин Г3х) ферментных препаратов, а также препарата с мацерирующим действием (Пектомацерин Г3х). Данные табл. 1 показывают, что в отличие от клубней [3, табл. 2], при гидролизе стеблей топинамбура наблюдаются значительно меньшие значения приведенной скорости реакции образования РС и степени конверсии биомассы. Это можно объяснить более высоким содержанием в зеленой массе б-целлюлозы (до 21.6% от а. с.в.), а также присутствием не углеводных компонентов, например, лигнина.

Табл. 1. Характеристики процесса гидролиза стеблей топинамбура

ферментными препаратами с разной субстратной специфичностью

Ферментный препарат	Содержание белка в реакционной смеси, мг/мл	Vпр×102, мг/мин×мг белка	Выход РС, мг/г а. с.в.	Степень конверсии после ВЭ-ФГ S, %
После ФГ	После ВЭ-ФГ
Целловиридин Г20х	1.12	2.84	54.2	153.2	63.5
Пектофоетидин Г20х	2.54	2.44	89.2	194.2	63.7
Пектомацерин Г3х	1.04	2.19	42.9	150.5	63.0
Глюкаваморин Г3х	0.30	2.17	35.2	132.7	62.7

При использовании Глюкаваморина Г3х наблюдается несколько более высокая скорость гидролиза стеблей, по сравнению с клубнями, что связано, по-видимому, с наличием крахмала в составе надземной части – 0.67-2.44 % от а. с.в. [2].

В табл. 2 приведены результаты гидролиза стеблей топинамбура с помощью некоторых композиций ФП. Из данных таблицы видно, что для всех комбинаций наблюдается взаимное усиление каталитического действия по сравнению с отдельными ФП. Это объясняется сложным компонентным составом структурных полисахаридов надземной части топинам-бура, в который помимо целлюлозы, входят также пектин и крахмал. Наиболее высокая скорость гидролиза была достигнута при использовании трехкомпонентной композиции пре-паратов Целловиридин Г20х – Пектофоетидин Г20х – Глюкаваморин Г3х, взятых в соотноше-нии 2:2:1 по массе.

Табл. 2. Характеристики процесса гидролиза стеблей топинамбура полиферментными композициями

Ферментный препарат	Содержание белка в реакционной смеси, мг/мл	Vпр×102, мг/мин×мг белка	Выход РС, мг/г а. с.в.	Степень конверсиипосле ВЭ-ФГ S, %
После ФГ	После ВЭ-ФГ
Целловиридин Г20х + Пектофоетидин Г20х (2:1)	1.60	4.82	110.9	266.8	66.2
Целловиридин Г20х+ Пектомацерин Г3х (2:1)	1.10	4.27	75.5	169.3	63.0
Целловиридин Г20х + Глюкаваморин Г3х (2:1)	0.85	4.46	84.7	181.4	63.2
Пектофоетидин Г20х + Целловиридин Г20х (2:1)	2.07	4.28	108.6	214.3	64.1
Пектофоетидин Г20х + Пектомацерин Г3х (2:1)	2.04	3.34	101.6	248.3	64.3
Пектофоетидин Г20х + Глюкаваморин Г3х (2:1)	1.79	3.06	85.6	174.5	63.1
Целловиридин Г20х + Пектофоетидин Г20х+ Глюкаваморин Г3х (2:2:1)	1.52	11.74	228.2	452.5	72.9

Сравнение данных табл. 2 с аналогичными результатами гидролиза клубней топинам-бура [3, табл. 3], позволяет сделать вывод о том, что стебли топинамбура являются менее реакционно способным субстратом, чем биомасса клубней. На это указывают существенно меньшие значения приведенной скорости реакции и степени конверсии, полученные после гидролиза стеблей. В целом это приводит к необходимости увеличения концентрации ФП в реакционной смеси и времени обработки при гидролизе стеблей топинамбура.

Табл. 3. Результаты гидролиза образцов жмыха клубней

топинамбура после ТФФ композицией Целловиридин Г20х – Пектофоетидин Г20х (1:1)

Образец	Продолжительность ТФФ, сутки	Скорость реакции Vпр×102, мг/мин×мг белка	Выход Р после ФГ, мг/г а. с.в.	Степень конверсии S, %
Без ТФФ	-	14.6	343.6	87.1
ТФФ Saccharomyces cerevisiae	1	14.5	284.9	86.5
3	14.9	321.1	89.2

В технологических процессах переработки клубней топинамбура, связанных с получением инулина, отбор сока топинамбура производится в диффузионных батареях под давлением и при более высокой температуре, чем при ВЭ, использованной в эксперименте.

Остаток после отбора сока – жмых топинамбура, который составляет до 15% от суммы сухих веществ, подвергается, таким образом, более жесткой температурной и механической обработке, по сравнению с массой после ВЭ. В табл. 3 приведены результаты гидролиза жмыха композицией Целловиридин Г20х – Пектофоетидин Г20х (1:1) без предварительной обра-ботки и после твердофазной ферментации (ТФФ) дрожжевой культурой Saccharomyces cerevisiae. Жмых был получен после ВЭ при 95 °С в течение 3-х часов, то есть практически в условиях разваривания, с последующим отжимом массы.

При сравнении данных табл. 3 с результатами гидролиза клубней топинамбура после ВЭ и ТФФ [3, табл. 4] видно, что при гидролизе жмыха достигается более высокая приведенная скорость реакции (выше в 1.2 раза) и выход РС после ферментативного гидролиза (выше в 2.2 раза). Это позволяет сделать вывод о том, что жмых, образующийся после отделения сока при получении инулина является несколько более реакционно способным субстратом, чем масса после ВЭ. Предварительная ТФФ дрожжами Saccharomyces cerevisiae практически не влияет на скорость ФГ и даже приводит к некоторому снижению выхода РС.

В табл. 4 приведены результаты гидролиза смешанных субстратов, состоящих из клубней и стеблей, а также из жмыха после отбора сока и стеблей топинамбура с помощью композиции препаратов Целловиридин Г20х – Пектофоетидин Г20х – Глюкаваморин Г3х, взятых в соотношении 2:2:1 по массе. Клубни и стебли перед обработкой не подвергались ВЭ для сохранения активности комплекса гидролаз топинамбура (КГТ).

Табл. 4. Характеристики процесса гидролиза смешанных субстратов композицией

Целловиридин Г20х – Пектофоетидин Г20х – Глюкаваморин Г3х (2:2:1 по массе)

Субстрат	Содержание белка в реакционной смеси, мг/мл	Скорость реакции Vпр×102, мг/мин×мг белка	Выход РС, мг/г а. с.в.	Степень конверсии S, %
Клубни + стебли (1:2)	3.15	18.18	838.2	84.3
Жмых + стебли (1:1)	1.52	15.17	420.4	82.1

Полученные результаты показали возможность достаточно быстрой конверсии биомассы топинамбура в сахара, необходимые для получения биотоплива. Для этих целей можно рассмотреть два варианта переработки: процесс, совмещенный с получением инулина и процесс полной переработки биомассы топинамбура в биотопливо. Первый вариант включает получение биотоплива за счет ферментативной обработки жмыха, остающегося после отбора сока топинамбура с помощью ВЭ при высокой температуре и давлении. В этом случае целесообразно смешивать жмых с измельченной массой стеблей, ориентировочно в соотно-шении 1:1 по массе а. с.в., и проводить ФГ с помощью трехкомпонентной композиции препа-ратов Целловиридин Г20х – Пектофоетидин Г20х – Глюкаваморин Г3х (2:2:1 по массе).

При полной переработке биомассы топинамбура в биотопливо целесообразно проводить ферментативный гидролиз смешанного сырья, полученного на основе клубней и стеблей, взятых в соотношении 1:2, также с помощью композиции Целловиридин Г20х – Пектофоети-дин Г20х – Глюкаваморин Г3х (2:2:1 по массе) в присутствии КГТ, то есть без предвари-тельной водной экстракции.

Выводы

Проведена оценка культуры Helianthus tuberosus L (топинамбур) как потенциального биотехнологического объекта для биоконверсии в сбраживаемые производные с целью получения биотоплива.
Дана сравнительная характеристика реакционной способности биомассы стеблей и клубней топинамбура при гидролизе ферментными комплексами с разной субстратной специфичностью. Показано, что биомасса стеблей топинамбура, имея более высокое содержание свободных сахаров, по сравнению со свежими клубнями, проявляет меньшую реакционную способность, что требует увеличения концентрации ферментных препаратов и большей продолжительности обработки при ферментативном гидролизе.
Установлен оптимальный состав композиции ферментных комплексов для гидролиза биомассы стеблей и жмыха топинамбура после отбора сока для выделения инулина. Пока-зана возможность гидролиза смешанных субстратов клубни-стебли и жмых-стебли с помо-щью трехкомпонентной композиции на основе целлюло-, пектино - и амилолитических ферментных препаратов.

Литература

J. S.D. Bacon, R. Loxley. Seasonal changes in the carbohydrates of the Ierusalem artichoke tubers. Biochem. J. 1952. Vol.51. No.2. P.208. , Арасимович топинамбура. Изд. Штиинца, Кишинев. 1974. 88с. Донцов фитомассы Helianthus tuberosus  L (топинамбур) в сахара для производства биотоплива. Часть 1. Биоконверсия клубней топинамбура. Бутлеровские сообщения. 2015. Т.43. №8. С.119-126. ROI: jbc-01/15-43-8-119 N. Nelson. A photometric adaptation of the Somogyi method for the determination of glucose. J. Biol. Chem. 1944. Vol.163. P.375-380. M. Somogyi. A new reagent for the determination of sugars. J. Biol. Chem. 1945. Vol.160. P.61-68 , , Ванчикова условий определения белка в ферментных растворах по методу Лоури. Заводская лаборатория. Диагностика материалов. 2009. Т.75. №2. С.18-20.

In the English version of this article, the Reference Object Identifier – ROI: jbc-02/16-45-2-131

Thematical direction: Bioconversion of biomass of Helianthus tuberosus L (Jerusalem artichoke) into sugars for biofuel production. Part 2.

Jerusalem artichoke stalks bioconversion

© Andrey G. Dontsov
Laboratory of Biochemistry and Biotechnology. Institute of Biology of Komi Scientific Center of UB RAS.

Communist St., 28. Syktyvkar, 167982. Republic of Komi. Russia.
Phone: [phone]. E-mail: *****@***komisc. ru

Keywords: Jerusalem artichoke stalks, enzymatic hydrolysis, enzyme compositions, biofuel.

Abstract

The assessment of culture of Helianthus tuberosus L (Jerusalem artichoke) as potential biotechnological object for bioconversion in the fermented derivatives for the purpose of receiving biofuel was carried out. The comparative characteristic of reactionary ability of biomass of stalks and tubers of Jerusalem artichoke at hydrolysis is given by enzyme complexes with different substrate specificity. The optimal composition of the enzyme complexes for hydrolysis of biomass of stalks and oilcake of Jerusalem artichoke after selection of juice for isolation of inulin was established. The possibility of hydrolysis of the mixed substrates tubers-stalks and oilcake-stalks by means of three-component composition on a basis the cellulolytic, pectinolytic and amylolytic enzyme  preparations is shown.