Синтез фрагментов пептида Prostatic Acid Phosphatase РАР(248-261), РАР(262-270), РАР(248-286) и их характеризация методом масс-спектрометрии

УДК 577.32

Синтез фрагментов пептида Prostatic Acid Phosphatase РАР(248-261), РАР(262-270), РАР(248-286) и их характеризация методом масс-спектрометрии

© Филиппов1*+ Андрей Васильевич, Котенков1 Сергей Александрович, Никулин1 Станислав Геннадиевич, Герасимова1 Елена Александровна, Валиева1 Резеда Рашидовна, Анцуткин2 Олег Николаевич и Афонин3 Сергей

1Кафедра физики молекулярных систем. Физический институт. Казанский (Приволжский) федеральный университет. Ул. Кремлевская, 18. г. Казань, 420008. Республика Татарстан. Россия.

Тел.: [phone]. E-mail: Andrey. *****@***ru

2Interface Chemistry. Luleе University of Technology. Regnbagsallen, 14, 97187 Luleе, Sweden.

Tel.: [phone]. E-mail:Oleg. *****@***se

3 Institute of Organic Chemistry. Karlsruhe University. Fritz-Haber-Weg 6, D-76131 Karlsruhe, Germany.

Tel.: [phone]. E-mail: Sergiy. *****@***edu

_______________________________________________

*Ведущий направление; +Поддерживающий переписку: andrey. *****@***ru

Ключевые слова: Prostatic Acid Phosphatase (РАР), синтез, экстракция эфиром, очистка HPLC, масс-спектрометрия.

Аннотация

Описан синтез фрагментов пептида Prostatic Acid Phosphatase (РАР): РАР(248-261), РАР(262-270), РАР(248-286). Экспериментально изменены и рассчитаны массовые спектры этих пептидов. Расчеты хорошо воспроизводят эксперимент. Показано, что короткие фрагменты РАР(248-261) и РАР(262-270) не нуждаются в дополнительной очистке. Синтез полноразмерного пептида РАР(248-286) приводит к получению вещества, которое нуждается в последующей очистке. Для гидрофобного фрагмента РАР(262-270) часть молекул пептида связана с ионом натрия, а еще одна часть – с ионом хлора.

Введение

Пептид Prostatic Acid Phosphatase (РАР) привлекает внимание тем, что он принимает участие в нормальных физиологических процессах (оплодотворение) и в развитии ряда опасных патологий, таких как заражение вирусом иммунодефицита человека и некоторые формы рака. Фрагмент этого пептида РАР(248-286) образует фибриллы, известные как SEVI (Semen-driven Enhancer of Virus Infection), присутствие которых в 2-5 раз повышает риск заражения вирусом ВИЧ (HIV) [1]. Известно, что пептид присутствует в организме в мономерной и амилоидной формах, однако детали взаимодействия молекул между собой при образовании амилоида остаются малоизученными. Прояснить особенности формирования амилоида и роль биомембраны в этом процессе может помочь исследование более мелких фрагментов РАР. В данной работе мы синтезировали фрагменты пептида, которые, согласно работам группы Рамоморти [2] образуют при нормальной рН и температуре различные вторичные структуры. На схеме показана первичная аминокислотная последовательность РАР(248-286) и выделены три различных фрагмента, которые мы синтезировали. Фрагмент РАР, РАР(248-286), имеет в первичной структуре 39 аминокислот.

GIHKQKEKSRLQGGVLVNEILNHMKRATQIPSYKKLIMY

Первый фрагмент, выделенный готическим шрифтом, РАР(248-261), образует случайный клубок. Второй фрагмент, выделенный подчеркиванием, РАР(262-270), образует б-спираль.

Экспериментальная часть

Синтез производили с использованием автоматического синтезатора пептидов ABI 433A (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), используя аминокислоты защищенные 9-флуоренилметокси-карбонильными группами с контролем процесса через измерение проводимости реакционной смеси [3,4]. Отделение пептида от субстрата и защитных групп производилось в кислой среде на основе трифторуксусной кислоты с последующей экстракцией терт-метил-бутиловым эфиром. Отделение целевого пептида от сопутствующих продуктов синтеза производили на жидкостном хроматографе Series 200 Perkin Elmer HPLC System (Waltham, MA, USA) в линейном градиенте вода-ацетонитрил при температуре 50оС. После очистки раствор пептида в смеси вода-ацетонитрил замораживался при температуре жидкого азота и лиофилизовался при давлении ниже 10-3 мм. рт. ст. Полученный порошок пептида хранился в запаянной ампуле при температуре -70оС до использования. Массовые спектры получали методом MALDI-TOF (Matrix-Assisted Laser Desorption-Ionization Time-Off-Flight) используя прибор BrukerBiflexIV.

Расчет массовых спектров с учетом природного распределения изотопов Н (1 и 2 Да), С (13 и 14 Да), О (16, 17 и 18 Да) и N (14 и 15 Да) проводили вручную с использованием программы Excell и используя on-line версию программы ChemCalc [5] Ecole Polytehnique Fйdйrale de Lausanne и Institute of Chemical Sciences and Engineering (Лозанна, Швейцария).

Результаты и их обсуждение

Результаты экспериментов и расчетов представлены на рисунках 1-3. На рисунке 1 сверху показаны спектры РАР(248-261), полученные непосредственно после экстракции синтезированного пептида эфиром и после выделения целевого пептида методом HPLC. Спектры практически совпадают, следовательно, уже синтез и экстракция эфиром для такого короткого фрагмента пептида обеспечивают высокое качество его очистки. Сравнение с расчетным спектром показывает также совпадение и по форме спектра и по среднему значению молекулярной массы (1606 Да).

На рисунке 2 показаны спектры неочищенного фрагмента РАР(262-270). Этот фрагмент характеризуется более высокой гидрофобностью [2] и плохой растворимостью в водных растворах. На экспериментальном спектре (сверху) присутствуют три группы линий. Только одна из этих групп (наиболее интенсивная, слева) соответствует расчетному спектру (снизу). Оставшиеся две группы линий могут относиться как к побочным продуктам синтеза, так и к измененным молекулам целевого пептида вследствие их связывания с ионами, присутствующими в окружении.

Рисунок 1. Массовые спектры фрагмента пептида РАР(248-261): сверху полученные экспериментально синтезированный и очищенный HPLC; снизу расчетный.

Рисунок 2. Массовые спектры фрагмента пептида РАР(262-270): сверху полученный экспериментально без очистки HPLC; снизу расчетный.

Оценки показывают, что различие наиболее интенсивных линий первой и второй групп линий спектра составляет около 22 Да, а первой и третей линий – около 38 Да. Такое различие может быть объяснено в предположении, что часть молекул пептида связана с ионом натрия (вторая группа), а еще одна часть – с ионом хлора (третья группа). В первом случае молекула теряет один протон, а во втором случае дополнительно приобретает три протона. Следовательно, и в случае синтеза РАР(262-270) синтез и экстракция эфиром обеспечивают высокое качество очистки пептида. Спектр целевого пептида совпадает с расчетным как по форме, так и по значению средней молекулярной массы (1091 Да).

В целом, как РАР(248-286), так и РАР(262-270) не нуждаются в дополнительной очистке, так как полученное вещество содержит более 98% целевого пептида.

Рисунок 3. Массовый спектр пептида РАР(248-286): сверху экспериментальный без очистки HPLC, снизу расчетный.

Для случая полноразмерного пептида получить в достаточной мере разрешённый спектр не удалось (Рисунок 3). В этом случае видно присутствие веществ с молекулярной массой значительно меньшей расчетной, которое нельзя объяснить связыванием со свободными ионами. Очевидно, что это сопровождающие продукты реакции. Таким образом, синтез полноразмерного пептида РАР(248-286) приводит к получению пептида, который нуждается в последующей очистке.

Заключение

Фрагменты пептида Prostatic Acid Phosphatase могут быть синтезированы методом твердофазного пептидного синтеза и охарактеризованы методом масс-спектроскопии. Качество полученного продукта зависит от длины пептида и его гидрофобности.

Выводы

В работе продемонстрированы возможности метода масс спектрометрии для характеризации синтетических пептидов из 9 - 39 аминокислотных остатков на примере фрагментов пептида Prostatic Acid Phosphatase (РАР). Показано, что короткие пептиды РАР(248-261) и РАР(262-270) не нуждаются в дополнительной очистке HPLC после экстракции синтезированного пептида эфиром. Синтез пептида из 39 аминокислотных остатков РАР(248-286) приводит к получению вещества, которое нуждается в последующей очистке. Для гидрофобного фрагмента РАР(262-270) часть молекул пептида связана с ионом натрия, а еще одна часть – с ионом хлора.

Благодарности

Работа поддерживается грантом Российского Фонда Фундаментальных Исследований (проект № 12-04-00011-а).

Литература

Munch J., Ruckert E., Standker L., et al. Semen-driven amyloid fibrils drastically enhance HIV infection. Cell. 2007. Vol.131. P.1059-1071. Nanga R. P.R., Brender J. R., Vivekanandan S., Popovich N., Ramamoorthy A. NMR structure in a membrane environment reveals putative amyloidogenic regions of the SEVI precursor peptide PAP248-286. J. Amer. Chem. Soc. 2009. Vol.131. P.17972-17979. Merrifield R. B. Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc. 1963. Vol.85.P.2149. Jones J. Amino acid and peptide synthesis. N.-Y.: Oxford University Press. 2002. 92 p. http://www. chemcalc. org/

Synthesis of Prostatic Acid Phosphatase РАР(248-261), РАР(262-270), РАР(248-286) peptide fragments and theirs characterization by Mass Spectrometry

© Filippov1*+ Andrey Vasil’evich, Kotenkov1 Sergey Alexandrovich, Nikulin1 Stanislav Gennadievich, Gerasimova1 Elena Alexandrovna, Valieva1 Rezeda Rashidovna, Antzutkin2 Oleg Nikolaevich and Afonin3 Sergiy

1 Molecular Physics Division. Institute of physics. KFU. Kremlevskaya, 18. Kazan, 420008. Tatarstan Republic. Russia. Tel.: [phone]. E-mail: Andrey. *****@***ru.

2Interface Chemistry. Luleе University of Technology. Regnbagsallen, 14, 97187 Luleе, Sweden.

Tel.: [phone]. E-mail:Oleg. *****@***se

3 Institute of Organic Chemistry. Karlsruhe University. Fritz-Haber-Weg 6, D-76131 Karlsruhe, Germany.

Tel.: [phone]. E-mail: Sergiy. *****@***edu

Keywords: Prostatic Acid Phosphatase (РАР), synthesis, Ether Extraction, HPLC purification, mass spectrometry.

Abstract

In this paper, we describe the synthesis technique of Prostatic Acid Phosphatase (РАР) peptide fragments: РАР(248-261), РАР(262-270), РАР(248-286). Experimentally obtained molecular mass spectra of synthesized peptide fragments by means of mass spectrometry are in good agreement with the theoretical molecular mass spectra determined from a knowledge of the isotopic distribution that fragments. It is shown than there is no need in additional purification by chromatography for such short fragments as РАР(248-261) and РАР(262-270) after Ether Extraction Procedure. On the contrary after the synthesis of full length peptide РАР(248-286) post-synthesis mixture has to be purified by chromatography. For hydrophobic segment РАР(262-270) we found that one part molecules of the segment is bound with Na+ ions, other part is bound with Cl - ions.

Графический абстракт

, , и интез фрагментов пептида Prostatic Acid Phosphatase РАР(248-261), РАР(262-270), РАР(248-286) и их характеризация методом масс-спектрометрии. Ключевые слова: Prostatic Acid Phosphatase (РАР), синтез, экстракция эфиром, очистка HPLC, масс-спектрометрия. Тип публикации: полная исследовательская публикация. Регистрационный код: выставляется редакцией   Страницы: ….