Эффективность использования лентивирусных векторов для генетической трансформации эмбриональных клеток кур
ФГБНУ Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства имени академика , п. Дубровицы, Россия, e-mail:
Лентивирусные вектора являются эффективным инструментом для введения и выражения генов и рассматривается в качестве одного из перспективных способов генетической модификации сельскохозяйственной птицы. Целью работы являлось изучение условий введения трансгенов в эмбриональные клетки кур для оптимизации условий введения лентивирусных векторов в эмбрионы кур в условиях in vivo. В работе была использована модифицированная лентивирусная векторная система второго поколения, в состав которой входили три различные плазмиды: psPAX2, pLPG и pWPXL (самоинактивирующийся лентивирусный вектор). Были получены две генные конструкции на основе самоинактивирующегося лентивирусного вектора, содержащие ген eGFP под контролем промотора вируса саркомы Рауса (RSV) или гибридного энхансер-промотора (CAG). Введение вирусных препаратов в эмбрионы кур осуществляли на разных сроках инкубации. Эффективность трансформации и число интегрированных копий трансгена оценивали методом real-time PCR (RT-PCR). Путем изменения соотношения плазмид были получены вирусные препараты с титром более 107 КОЕ/мл, а после концентрации ультрацентрифугированием – 5 x 108 КОЕ/мл. Было показано, что, изменяя соотношения между компонентами векторной системы по сравнению со стандартной схемой, можно значительно увеличить титр вируса. Полученные титры вирусного препарата позволили инфицировать 30-35 % клеток на ранних этапах развития эмбрионов кур, что указывает на то, что только часть клеток эмбриона может быть инфицирована вирусом. При введении вирусных препаратов с одинаковыми титрами в эмбрионы кур на разных сроках инкубации были получены популяции эмбриональных клеток с различным количеством копий вектора в составе клеточного генома. Таким образом, эффективность переноса генов в эмбрионы кур с использованием лентивирусных векторов не зависит от стадии развития эмбриона и может быть прогнозируемой.
