Лекция № 3 Методы оптической спектроскопии со сверхвысоким разрешением

Лекция № 3

Методы оптической спектроскопии со сверхвысоким разрешением

План лекции:

Введение

1. Разрешающая способность оптических приборов

2. Методы спектроскопии со сверхразрешением

Заключение. Значение открытия

Контрольные вопросы.

Введение

Благодаря зрению мы получаем 90% информации об окружающем нас мире. Именно поэтому микроскопия играет огромную роль для исследователей в различных областях современной науки (физики, химии, биологии).

Изучением особенности взаимодействия излучения (света) с частицами, размер которых меньше длины волны занимается нанооптика. Технологии в области нанооптики включают сканирующую оптическую микроскопию ближнего поля, фотоусиленную сканирующую туннельную микроскопиию и спектроскопию поверхностного плазмонного резонанса. Традиционная микроскопия для точной фокусировки света использует дифракционные элементы с целью повышения разрешения. Однако, из-за дифракционного предела (известного как критерий разрешения Релея) распространяющийся свет может быть сфокусирован в пятно с минимальным диаметром, составляющим половину длины волны света. Следовательно, для дифракционно-ограниченной микроскопии максимально достижимое разрешение составляет около двухсот нанометров.

Долгое время в оптике считалось, что существует фундаментальное ограничение разрешающей способности оптического изображения. Однако использование структур нанометровых размеров сделало возможным создать микроскоп, с помощью которого был преодолен дифракционный предел в оптике. Пространственное разрешение этого микроскопа зависит от условий освещения. Предельные разрешения достигнутые в последнее время в

видимом диапазоне спектра составляют примерно 5-10 нм, а при развитии данной технологии теоретически можно достигнуть разрешение в 1 нм (рис. 1).

Это позволит изучать молекулы, различные биологические объекты без их повреждения и в естественном окружении (in vivo) [5].

В 2014 г. Нобелевская премия по химии была присуждена Эрику Бетцигу (США), Уильяму Мернеру (США) и Штефану Хеллю (Германия) за развитие методов флуоресцентной микроскопии со сверхвысоким разрешением (рис. 2).

Эти методы получили широкое распространение начиная с 2008 года, когда микроскопия сверхвысокого разрешения была признана «методом года» в специальном выпуске журнала Nature Methods.

1. Разрешающая способность оптических приборов

Как известно, основную долю информации об окружающем мире человек получает с помощью зрения. Глаз человека — один из сложнейших и совершенных приборов. Этот прибор, созданный природой, работает со светом — электромагнитным излучением, диапазон длин волн которого находится между 400 и 760 нанометрами. Цвет, который при этом воспринимает человек, изменяется от фиолетового до красного.

Электромагнитные волны, соответствующие видимому свету, взаимодействуют с электронными оболочками атомов и молекул глаза. Результат этого взаимодействия зависит от того, в каком состоянии находятся электроны этих оболочек. Свет может поглощаться, отражаться или рассеиваться. Что именно произошло со светом, может многое рассказать об атомах и молекулах, с которыми он взаимодействовал. Диапазон размеров атомов и молекул от 0,1 до десятков нанометров. Это во много раз меньше, чем длина волны света. Тем не менее, объекты именно таких размеров — которые называются нанообъектами — очень важно видеть современным ученым.

Давайте вспомним из курса общей физики какие проблемы встают перед учеными, которые начинают наблюдать такие нанообъекты.

Рассмотрим водителя автомобиля, который едет ночью по прямому неосвещенному шоссе. В какой то момент времени, ему попадется другая машина, которая едет ему навстречу с включенным дальним светом фар. Сначала он увидит вдали размытое световое пятно. Однако по мере ее приближения начнет различать два отдельных источника света.

Вопрос: как близко должна находиться встречная машина, чтобы мы начали воспринимать две фары по отдельности? Конечно при этом не забываем, что свет фар встречной машины мы наблюдаем через оптический прибор, которым является человеческий глаз.

Для ответа на этот вопрос нам будет необходимо вспомнить основные положения волновой теории света и критерий, сформулированный Рэлеем в 1896 году.

Лорд Рэлей — один из ярких представителей поколения британских ученых. Изучая феномен рассеяния света, Рэлей сформулировал весьма важный критерий различимости источников света в оптических приборах, который теперь носит его имя.

Критерий Рэлея: два точечных источника света различимы в окуляре, если дифракционный максимум одного из них накладывается на дифракционный минимум другого.

Согласно классической теории дифракции, луч света от удаленного источника, попадая в круглый окуляр, формирует изображение, состоящее из ряда светлых и темных концентрических полос вокруг яркой центральной точки, — так называемую дифракционную картину (рис. 3).

Законы оптики говорят нам, что реальный источник света в нашем восприятии будет размыт, и такое размытие наблюдается в любом оптическом приборе. Если мы наблюдаем два близких источника света, их размытые образы накладываются один на другой. Рэлей показал, что если центральное световое пятно дифракционной картины одного источника света удалено от центрального светового пятна другого источника света на расстояние не менее радиуса первой темной дифракционной полосы, то мы начинаем воспринимать два источника света раздельно: это расстояние называется - линейным разрешением оптического прибора. Если два источника света удалены друг от друга на расстояние d, расстояние от них до нас равно D, длина световой волны равна л, а диаметр окуляра равен А, то, согласно критерию Рэлея, условием оптического разрешения двух источников в окуляре будет:

d/D > 1,22л/A

Иными словами, если точечные источники света разнесены на расстояние не меньше d, наблюдатель, находясь на удалении D, сможет различить их в окуляре диаметром А как раздельные, в противном случае они сольются. Отношение d/D представляет собой угловую меру в радианах (для перевода в градусы нужно умножить ее на 57,3) между направлениями на два источника света. Критерий Рэлея, таким образом, устанавливает границы углового разрешения для любого оптического инструмента, будь то телескоп, фотоаппарат или человеческий глаз.

Согласно критерию Рэлея, оптическое разрешение человеческого глаза в идеальной ситуации равняется 25 угловым секундам. На практике же даже самые зоркие люди способны различать источники света с разрешением от 2 до 5 угловых минут — то есть на порядок хуже (рис. 4). И виновата в этом сетчатка глаза — ее строение не обеспечивает полного использования возможностей хрусталика. Таким образом, возвращаясь к ранее приведенному примеру с автомобилями, две фары на прямом шоссе можно было бы различить как два отдельных источника света с расстояния около 10 км. На практике же человеческий глаз начинает различать их лишь с расстояния около 1 км. Реальный водитель, скорее всего, будет просто ослеплен и постарается сосредоточиться на дороге, в результате чего воспримет свет двух встречных фар раздельно с еще меньшего расстояния.

Для того чтобы можно было различать объекты, расположенные на еще меньших расстояниях друг от друга, был придуман оптический микроскоп — прибор, увеличивающий разрешающую способность глаза (рис. 5).

Обычно, когда говорят о разрешающей способности того или иного оптического прибора, оперируют двумя понятиями. Одно из них — угловое разрешение, а второе — линейное разрешение. Эти понятия взаимосвязаны.

Линейное разрешение — минимальное расстояние между различимыми объектами в микроскопии.

Угловое разрешение — минимальный угол между объектами, который может различить оптическая система.

К примеру, для человеческого глаза угловое разрешение составляет приблизительно 1 угловую минуту. При этом глаз может различить два точечных объекта, удаленных от него на 25–30 см, только тогда, когда расстояние между этими объектами больше чем 0,075 мм. Это вполне сравнимо с разрешением обычного компьютерного сканера. В самом деле, разрешение 600 точек на дюйм означает, что сканер может различить точки, расположенные на расстоянии 0,042 мм друг от друга.

Оптический микроскоп позволил отодвинуть предел разрешения до долей микрона. Уже 100 лет назад оптическая микроскопия сделала возможным изучать объекты микронных размеров. Однако тогда же стало ясно, что простым увеличением количества линз и улучшением их качества добиться дальнейшего увеличения разрешающей способности невозможно. Разрешение оптического микроскопа оказалось ограничено свойствами самого света, а именно его волновой природой [1].

Рис. 5. Оптические микроскопы: слева — микроскоп фирмы Carl Zeiss 1906 года; справа — современный исследовательский микроскоп той же фирмы с двумя видеокамерами на основе ПЗС-матриц сверху.

Еще в конце позапрошлого века было установлено, что разрешение оптического микроскопа составляет . В этой формуле л — длина волны света, а nsin(u) — числовая апертура объектива микроскопа, которая характеризует как микроскоп, так и то вещество, с показателем преломления среды n, которое находится между объектом изучения и самой близкой к нему линзой, и угол u между оптической осью объектива и самыми крайними лучами, которые выходят из объекта и могут попасть в этот объектив. Показатель преломления вакуума равен единице. У воздуха этот показатель очень близок к единице, у воды он составляет 1,33303, а у специальных жидкостей, используемых в микроскопии для получения максимального разрешения, n доходит до 1,78. Каким бы ни был угол u, величина sin(u) не может быть больше единицы. Таким образом, разрешение оптического микроскопа не превышает долей длины волны света. Обычно считается, что разрешение составляет половину длины волны.

Если мы исследуем объекты, размеры которых очень малы по сравнению с длиной волны света, то они будут иметь одинаковые форму и размеры, не зависящие от формы самих объектов. Такие объекты называют точечными — их размерами можно пренебречь. Если такой точечный объект светится, то оптический микроскоп изобразит его в виде светлого кружка, окруженного светлыми и темными кольцами. Типичное изображение точечного источника света, полученное с помощью оптического микроскопа, показано на рисунке 6. Интенсивность светлых колец намного меньше, чем у кружочка, и убывает по мере удаления от центра изображения. Чаще всего видно только первое светлое кольцо. Диаметр первого темного кольца равен .

Рис. 6. Изображения одного и того же точечного источника, полученные с помощью объективов с различными числовыми апертурами

Функция, которая описывает такое распределение интенсивности, называется функцией рассеяния точки. Эта функция не зависит от того, каково увеличение. Изображение нескольких точечных объектов будет представлять собой именно круги и кольца, как это видно из рисунка 7.

Рис. 7. Изображения группы точечных источников. Источники 1 и 2 расположены на расстоянии, значительно большем d = л/(nsin(u)), источники 3 и 4 — на расстоянии d/2, а источники 5 и 6 — на расстоянии, значительно меньшем d/2.

Полученное изображение можно увеличивать, однако если изображения двух соседних точечных объектов сливаются, то они будут сливаться и дальше. Такое увеличение часто называют бесполезным — большие изображения просто будут более размытыми. Пример бесполезного увеличения показан на рисунке 8.

Рис. 8. Изображения двух точечных источников, полученные объективами, имеющими одинаковые числовые апертуры, но дающими различные увеличения.

Формула часто называется дифракционным пределом, и она настолько знаменита, что именно ее высекли на памятнике автору этой формулы — немецкому физику-оптику Эрнсту Аббе.

Со временем оптические микроскопы стали снабжать разнообразными устройствами, позволяющими запоминать изображения. Человеческий глаз дополнили сначала пленочные фото - и кинокамеры, а потом — камеры, в основе которых лежат цифровые устройства, преобразующие попадающий на них свет в электрические сигналы. Самыми распространенными из таких устройств являются ПЗС-матрицы (ПЗС расшифровывается как прибор с зарядовой связью). Количество пикселей в цифровых камерах продолжает расти, однако само по себе это не может улучшить разрешение оптических микроскопов.

Еще двадцать пять лет назад казалось, что дифракционный предел непреодолим и что, для того чтобы изучать объекты, размеры которых во много раз меньше, чем длина волны света, необходимо отказаться от света как такового. Именно таким путем пошли создатели электронных и рентгеновских микроскопов. Несмотря на многочисленные преимущества таких микроскопов, задача использования именно света для рассматривания нанообъектов оставалась. Причин для этого было много: удобство и простота работы с объектами, небольшое время, которое требуется для получения изображения, известные способы окрашивания образцов и многое другое.

2. Методы спектроскопии со сверхразрешением

После долгих лет напряженной работы ученые нашли способы рассматривать нанообъекты с помощью оптического микроскопа. Наибольший прогресс в этом направлении достигнут в области люминесцентной микроскопии. Конечно, дифракционный предел никто не отменял, но его удалось обойти. В настоящее время существуют различные оптические микроскопы, позволяющие рассматривать объекты, размеры которых намного меньше длины волны того самого света, который создает изображения этих объектов. Все эти приборы объединяет один общий принцип [4].

Если у нас есть точечный источник, даже при наличии дифракционного предела разрешения, увидеть его не так уж сложно. Если этот источник обладает достаточной интенсивностью, его изображение будет отчетливо видно. Форма и размер этого изображения будут определяться свойствами оптической системы. При этом, зная свойства оптической системы и будучи уверенными в том, что объект точечный, можно определить, где именно находится объект. Точность определения координат такого объекта будет достаточно высокой. Иллюстрацией этого может служить рисунок 9. Координаты точечного объекта можно определить тем точнее, чем интенсивнее он светится. Еще в 80-х годах прошлого века с помощью оптического микроскопа умели определять положение отдельных светящихся молекул с точностью в 10–20 нанометров. Необходимым условием столь точного определения координат точечного источника является его одиночество. Ближайший к нему другой точечный источник должен находиться настолько далеко, чтобы исследователь точно знал, что обрабатываемое изображение соответствует одному источнику. Понятно, что это расстояние l должно удовлетворять условию . В этом случае анализ изображения может дать очень точные данные о положении самого источника.

Рис. 9. Последовательное определение положения точечного источника. Красным крестом отмечено текущее положение источника, а голубым цветом обозначена траектория движения источника, построенная по трем его положениям. Размер голубого кружка соответствует точности определения положения источника.

Большинство объектов, размеры которых намного меньше разрешающей способности оптического микроскопа, можно представить как набор точечных источников. Источники света в таком наборе находятся друг от друга на расстояниях, намного меньших величины . Если эти источники будут светить одновременно, то сказать что-либо о том, где именно они расположены, будет невозможно. Тем не менее, если суметь заставить эти источники светить по очереди, то положение каждого них можно определить с высокой точностью. Если эта точность превышает расстояние между источниками, то, обладая знанием о положении каждого из них, можно узнать о том, каково их взаимное расположение. А это означает, что получена информация о форме и размерах объекта, который представлен как набор точечных источников. Другими словами, в таком случае можно рассмотреть в оптический микроскоп объект, размеры которого меньше, чем дифракционный предел.

Таким образом, ключевым моментом метода -  является получение информации о различных частях нанообъекта независимо друг от друга. Существуют три основные группы методов, позволяющие сделать это.

Первая группа методов целенаправленно заставляет светить ту или иную часть исследуемого объекта. Самый известный из этих методов — сканирующая оптическая микроскопия ближнего поля. Если в качестве зонда взять миниатюрную диафрагму с отверстием в несколько нанометров - апертуру, то в соответствии с законами волновой оптики, видимый свет (с длиной волны несколько сотен нанометров) проникает в такое маленькое отверстие, но не далеко, а на расстояние, сопоставимое с размерами отверстия. Если в пределах этого расстояния, в так называемом «ближнем поле», поставить образец, рассеянный от него свет будет регистрироваться. Обычно это отверстие находится на конце заостренного и покрытого тонкой пленкой металла световода (световод часто называется оптическим волокном и широко используется для передачи данных на большие расстояния). Сейчас удается изготавливать отверстия с диаметрами от 30 до 100 нм. Таким же по величине получается и разрешение. Перемещая диафрагму в непосредственной близости от образца получаем растровое изображение поверхности. Приборы, работающие по этому принципу, называются сканирующими оптическими микроскопами ближнего поля. Они появились примерно 25лет тому назад [2].

Суть второй группы методов сводится к следующему. Вместо того чтобы заставлять соседние нанообъекты светить по очереди, можно использовать объекты, которые светятся разными цветами. В этом случае с помощью светофильтров, пропускающих свет того или иного цвета, можно определять положение каждого из объектов, а потом — составлять единую картину.

Третья группа методов, позволяющих преодолеть дифракционный предел и рассмотреть нанообъекты, использует свойства самих светящихся объектов. Существуют такие источники, которые можно «включать» и «выключать» с помощью специально подобранного света. Такие переключения происходят статистически. Иначе говоря, если имеется много переключаемых нанообъектов, то, подобрав длину волны света и его интенсивность, можно заставить «выключиться» только часть из этих объектов. Остальные объекты будут продолжать светить, и можно получить от них изображение. После этого надо «включить» все источники и снова «выключить» часть из них. Набор оставшихся «включенными» источников будет отличаться от набора, который остался «включенным» в первый раз. Повторяя такую процедуру много раз, можно получить большой набор изображений, отличающихся друг от друга. Анализируя такой набор, можно установить местоположение большой доли всех источников с очень высокой точностью, значительно превышающей дифракционный предел. Пример сверхразрешения, полученного таким способом, приведен на рисунке 10.

Рис. 10. Сравнение изображения, полученного с помощью обычного микроскопа (слева) и одним из методов оптического сверхразрешения (справа).

Сторона правого изображения соответствует 2,5 мкм. Это приблизительно в 10–12 раз больше, чем величина л/(2n sin u) для используемого объектива и длины волны света. Область, которая со сверхразрешением изображена на правом рисунке, на левом рисунке выделена квадратом.

В этом методе лазерный импульс возбуждает все флуоресцентные молекулы внутри пятна, ограниченного дифракционным пределом (диаметром около 0,25 мкм), в то время как другой лазерный импульс гасит флуоресценцию от всех молекул, кроме тех, которые находятся в самом центре возбужденного пятна, в объеме нескольких десятков нанометров. Только эти молекулы затем регистрируются детектором. Перемещая такой миниатюрный зонд вдоль образца и последовательно измеряя уровень освещенности, можно получить полную картину препарата. Чем меньше объем, в котором молекулам позволено флуоресцировать в каждом положении зонда, тем выше разрешение конечного изображения. Следовательно, в принципе, дифракционный предел может быть преодолен. На практике достигнутый предел разрешения, достигнутый методом STED, составляет около 40 нм. На основе данного метода уже выпускаются серийно производимые микроскопы (фирма Leitz, Германия) (рис. 11).

Рис. 11 Микроскоп со сверхразрешением

Заключение

Обычная флуоресцентная микроскопия имеет довольно низкое разрешение. Это определяется тем, что свет дифрагирует и, согласно пределу разрешения оптической микроскопии, сформулированному в конце XIX века Эрнстом Аббе, равен примерно половине длины волны света, то есть 200–250 нанометров. Поскольку в окружающем мире существует много структур, размеры которых значительно меньше этого предела, например, — молекулярные структуры, некоторые клеточные органеллы, — было необходимо разработать технологию с большим пространством разрешения. Но из-за дифракции света обычные микроскопы не позволяют этого достигать. Поэтому в таких случаях приходится использовать электронную микроскопию, которая хотя и может работать даже на атомарном уровне и в нанометровой шкале, но требует фиксации объекта наблюдения. В связи с этим с такой технологией невозможно работать, например, с живыми клетками.

Кроме того, в электронной микроскопии трудно пометить молекулу, которую вы хотите исследовать. Вы видите очень высокоразрешающую картинку, но где находится интересующая вас молекула (например, белок, который вы изучаете), увидеть довольно сложно. Флуоресцентная микроскопия, наоборот, позволяет очень специфически метить целевые структуры.

Таким образом, в сверхразрешающей микроскопии есть два основных преимущества: вы можете работать с любыми объектами и метить целевые структуры молекулы с помощью флуоресцентных красителей и флуоресцентных белков. Достигается это двумя основными способами — STED и методом детекции одиночных молекул.

STED — это технология, в которой существуют два лазера. Один из них — возбуждающий — светит в центр, а вокруг него бубликом располагают гасящий лазер. И этот второй лазер тушит все вокруг небольшого пятнышка, которое может быть нанометрового размера. Сканируя этими двумя лазерами с ярким центром, вы проходите по всему образцу и видите очень тонкую структуру с разрешением в нанометры. Эта система еще называется наноскопией.

Второй метод основан на детекции одиночных молекул. Если вы детектируете флуоресценцию от одной молекулы, то с помощью компьютера вы можете поставить в центр этого пятна маленькую точечку, которая соответствует вычисленной позиции флуорофора. Для этого надо знать, что это одна молекула, а не много. Если вы уверены в этом, то можно очень точно вычислить центр положения флуорофора, центр пятна. Если вы таким образом сфотографируете множество молекул и все эти центры поместите на одну картинку, у вас сложится картинка сверхвысокого разрешения. Но для этого надо сфотографировать порядка 100 000 или 1 000 000 молекул. Только тогда будет получено достаточно подробное изображение. Это достигается с помощью фотоактивированных флуоресцентных белков или фотоактивированных флуоресцентных химических красителей путем последовательной фотоконверсии и получения изображений некоторого количества одиночных молекул. За один раз вы сфотографируете, например, 100 молекул, потом вы их уничтожаете, они фотоотбелятся, поскольку они сгорают в ярком свете. После этого вы фотографируете следующие 100 молекул, потом следующие, пока не накопите достаточное количество молекул, чтобы получилось хорошее изображение. Этот тип микроскопии иногда называется «пуантилизмом» по аналогии с художниками, которые рисовали точечками.

В целом эта новая технология позволяет видеть очень тонкие структуры, которые ранее были недоступны для прямой визуализации. Возрастает детализация получаемой информации. Причем поскольку разрешение возросло на порядок, то, соответственно, информации для исследований стало поступать очень много.

Таким образом, современная микроскопия постепенно поднимается на новый уровень — наблюдение нанообъектов стало реальностью, а предел разрешающей способности микроскопа (предел Аббе) оказался преодолимым, и достигаемое теперь разрешение составляет 10–20 нм. В настоящее время оптическая микроскопия со сверхразрешением быстро развивается. Можно со всей уверенностью предполагать, что в грядущие годы эта область будет привлекать все большее число исследователей.

Контрольные вопросы:

1. Что такое разрешающая способность оптического прибора.

2. Как формулируется критерий Рэлея?

3. Основные методы спектроскопии со сверхразрешением

4. Каков предел разрешения достигнутый современными методами спектроскопии?

5. Приведите примеры практического использования методов нанооптики.

Список литературы:

1. ак рассмотреть нанообъект в оптический микроскоп. Квант Изд-во: ОО «Бюро Квантум», № 2, 2010, С. 23 – 26

2. Либенсон дифракционного предела в оптике. Соросовский образовательный журнал, том 6, №3, 2000, С. 99 – 104.

3. Новотный Л, Берт сновы нанооптики М.: ФИЗМАТЛИТ, 2009 – 484 с.

4. ифракционная нанофотоника. М.: ФИЗМАТЛИТ, 2011. — 680 с.

5. учше один раз увидеть, или микроскопия сверхвысокого разрешения. Эл. ресурс. Режим доступа:  http://biomolecula. ru/content/1138

6. Шутова принципы оптической микроскопии сверхвысокого разрешения. Эл. ресурс. Режим доступа: http://www. shoutovaoa. ru/