Биосорбенты тяжелых металлов на основе микромицетов активного ила

Публикация доступна для обсуждения в рамках функционирования постоянно

действующей интернет-конференции “Бутлеровские чтения”. http:///readings/

Посвящается 40-летию кафедры биотехнологии РХТУ им. .

Поступила в редакцию 07 мая 2017 г. УДК 579-66.

Биосорбенты тяжелых металлов на основе

микромицетов активного ила

© Тюпа1* Дмитрий Валериевич, Калёнов2+ Сергей Владимирович

и

1 Международный Биотехнологический Центр «Генериум». . поселок Вольгинский, 601125. Петушинский район. Владимирская обл. Россия. Тел.: [phone].

E-mail: *****@***ru

2 Кафедра биотехнологии. Факультет биотехнологии и промышленной экологии Российского химико-технологического университета им. . Миусская пл, 9. г. Москва, 125047. Россия.

Тел.: [phone]. E-mail: *****@***ru

_______________________________________________

*Ведущий направление; +Поддерживающий переписку

Ключевые слова: биосорбция, тяжелые металлы, сорбционная емкость, активный ил, медь, никель, цинк.

Аннотация

Извлечение тяжелых металлов из сточных вод гальванической промышленности при помощи биосорбентов считается более экономически выгодным методом по сравнению с использованием традиционных сорбентов, таких как ионообменные смолы и активированные угли. В данной работе была изучена биосорбция ионов меди, цинка и никеля биомассой культур плесневых грибов, выделенных из активного ила водоочистных сооружений – F. nivale, F. oxysporum и P. glabrum. Отобранные микроорганизмы спонтанно образуют прочные гранулы биомассы, устойчивые к высоким дозам тяжелых металлов, что позволяет им сорбировать металлы в больших количествах. Все три изученные культуры грибов оказались перспективными для создания биосорбентов тяжелых металлов, однако интенсивность сорбции ионов меди на порядок выше, чем данный показатель для цинка и никеля. В целях сорбции меди наиболее целесообразно использовать биомассу культуры F. oxysporum, которая обладает сорбционной емкостью более 400 мг/г по данному металлу. Ионы цинка и никеля активнее всего поглощает биомасса культура P. glabrum, которая сорбирует 35 мг никеля или 70 мг цинка на грамм сухой биомассы.

Полученные в ходе исследования биосорбенты быстро извлекают ионы металлов из растворов: оптимальное время сорбции составляет от 3 минут в случае меди до 15-20 минут при извлечении ионов никеля и цинка. Определены оптимальные для эффективной сорбции значения кислотности среды. Ионы цинка наиболее активно сорбируются при уровне рН 5.5, тогда как ионы никеля и меди грибная биомасса поглощает эффективнее всего при рН 7 и 9 соответственно. Было отмечено, что при разных значениях рН среды и использовании в качестве сорбентов различных культур грибов ионы металлов сорбируются с неодинаковой интенсивностью. Поэтому, данные культуры могут быть использованы в качестве селективных сорбентов тяжелых металлов. Постепенно защелачивая стоки гальванического производства, или последовательно внося в растворы гранулы различных грибных сорбентов, можно организовать раздельное извлечение ионов меди, цинка и никеля.

Введение

Сорбция тяжелых металлов из промышленных стоков – одна из главных проблем, связанных с деятельностью гальванических производств. Получение металлов из сточных вод экономически выгоднее, чем использованием первичного сырья, позволяет сократить энергетические и трудовые затраты, производственные площади и территории, отводимые под отвалы [1-3]. Очистка сточных вод, загрязненных солями меди, цинка и никеля, оказывающими негативное воздействие на водные и почвенные экосистемы, сообщества микроорганизмов активного ила водоочистных сооружений, а также на организм человека, важна с точки зрения экологии [4-6].

Наибольшее количество тяжелых металлов извлекается из растворов, представляющих собой продукты электролитического аффинажа первичного сырья. Технология его выделения несовершенна: метод нейтрализации сред ведет к образованию щелочных растворов, вторично растворяющих осажденный металл. Для доочистки стоков применяют ионообменные смолы, обладающие высокой сорбционной емкостью, но эти смолы дороги и не подлежат регенерации. Альтернативный метод извлечения металлов, основаны на применении активированных углей, экономически малоэффективен ввиду высокой стоимости углей и их быстрого механического износа [3, 8].

Многообещающей альтернативой физико-химических методов выделения тяжелых металлов является метод биосорбции, например, на основе мицелия плесневых грибов, представляющего собой отход производства антибиотиков. Основным преимуществом микробной сорбции металлов является доступность и дешевизна сорбентов, а главными недостатком – низкая сорбционная емкость, но подбор типа микроорганизма и условий биосорбции могут повысить ее эффективность.

Известны общие для различных групп микроорганизмов закономерности сорбции тяжелых металлов. Культуры извлекают около половины присутствующего в среде металла в первые пять минут процесса, а по истечении 2-3 часов сорбция завершается. Максимальная сорбционная емкость наблюдается при концентрациях металла свыше 100 мг/л, а для отдельных культур плавно возрастает до 500 мг/л [3, 8]. Степень извлечения металла зависит от кислотности среды. Защелачивание раствора повышает сорбционную емкость клеток, а при рН ниже 2 и выше 10 степень сорбции снижается вследствие кислотного либо щелочного гидролиза биомассы [8, 11]. Процесс биосорбции сильно зависит от температуры среды и замедляется при температурах ниже 20 и выше 50 °С из-за падения скорости диффузионных и адсорбционных процессов в первом случае, и вследствие термической денатурации биополи-меров и разрушения связывающих металл функциональных групп клеточной поверхности во втором [7, 10]. Сорбция металлов живыми клетками протекает интенсивнее, чем с участием мертвой биомассы. Сухие пекарские дрожжи сорбируют только 22-27% металлов из загряз-ненных вод, живые дрожжевые клетки – 65-99% [12-14].

Тип микроорганизма, жизнеспособность клеток, температура, рН среды и ее химический состав, концентрация ионов тяжелых металлов и время их контакта с клетками – основные факторы, определяющие эффективность процессов микробной сорбции. Подбор оптимальных значений данных параметров обеспечит экономически эффективное извлечения тяжелых металлов из стоков и требуемое качество очищаемой воды, следовательно, безопасность окружающей среды и человека.

Несмотря на обилие исследований в данной области, микробная сорбция металлов не применяется широко. Требуется поиск микроорганизмов, не уступающих по сорбционной емкости ионообменным смолам, и подбор ряда оптимальных параметров процесса биосорбции. Перспективный кандидат на роль подобного биосорбента – активный ил, аккумулирующий большие дозы металлов и обладающий высокой удельной площадью поверхности вследствие естественного гранулирования. Еще более перспективны выделенные из ила чистые культуры микроорганизмов, обладающие максимальной устойчивостью к действию тяжелых металлов и наибольшей сорбционной емкостью, изученные в данной работе.

Экспериментальная часть

Использовались три культуры микромицетов, выделенные из аэробного активного ила очистных сооружений: Fusarium nivale (F. n), Fusarium oxysporum (F. o) и Penicillium glabrum (P. g). Культуры отбирались, как наиболее устойчивые к действию тяжелых металлов компоненты активного ила. Их высокая жизнестойкость в условиях высокого содержания токсичных металлов частично объясняется способностью образовывать прочные гранулы. Они обладают высокой сорбционной емкостью по тяжелым металлам вследствие большой пористости клеточной поверхности, позволяющей мицелию сорбировать не только ионы металлов, но и коллоидные частицы [15-16] и образованию гранул размером 2-4 мм, что повышает удельную поверхность биомассы [7, 10].

Культуры растили на модифицированной среде Гаузе №1, имеющей следующий состав (в г/л): крахмал – 1.0, KNO3 – 1.0, K2HPO4 – 0.5, MgSO4⋅7H2O – 0.5, FeSO4⋅7H2O – 10-4. Питательные среды стерилизовали в автоклаве в течение 30 мин при 0.7 ати. Культивирование проводили на вращательной качалке (при 150 об/мин) при 27 °С в течение трех суток. Объем среды составлял 25% общего объема колб. Посевной материал вносили из расчета 10% объема среды. Перед засевом гранулы культур стерильно растирали в ступке в целях равномерного распределения биомассы в посевной суспензии.

Рост культур и количество накапливаемой биомассы оценивали по увеличению массы абсолютно сухого вещества (АСВ). Для этого отбирали по 25 мл культуральной жидкости, содержащей гранулы. Последние двукратно промывали водой, осаждая клетки на центрифуге в течение 15 мин при 3000 G. Супернатант сливали, биомассу переносили в бюкс и высушивали до постоянного веса при 105 °С. Критические значения токсического действия Cu2+, Zn2+ и Ni2+ на культуры определялись путем внесения до 30 г/л ионов металлов в среду перед засевом в виде солей CuSO4⋅5H2O, ZnSO4⋅7H2O и NiSO4⋅7H2O. После трехдневного жидкофазного культивирования степень ингибирования роста культур оценивали по уменьшению накопления АСВ в сравнении с контролем.

Для оценки интенсивности биосорбции металлов по завершении роста культур биомасса отделялась от культуральной жидкости фильтрацией через сито с диаметром отверстий 1 мм, что позволяло отделить мицелий, образующий гранулы размером 2-4 мм. Биомассу помещали в растворы, содержащие различное количество ионов металлов (до 3 г/л). Гранулы инкубировали в присутствии металлов во вращательной качалке при 150 об/мин от 1 до 30 мин. Биомассу удаляли из раствора, фугуя 15 мин при 3000 G и анализировали супернатант на содержание ионов металлов спектрофотометрическим методом. К растворам Cu2+ добавляли раствор аммиака и при 540 нм измеряли поглощение полученного синего раствора аммиаката меди. К растворам Zn2+ и Ni2+ добавляли индикатор эриохром черный Т и при 540 нм измеряли поглощение растворов комплекса, имеющего в щелочной области синюю окраску. В целях оптимизации процесса биосорбции варьировались основные параметры данного процесса: тип микроорганизма, концентрация ионов металлов (до 3 г/л), время контакта биосорбента с растворами солей металлов и значение рН раствора, изменяемое в интервале от 2 до 11 добавлением в среду двухнормального раствора HCl, либо NH4OH.

Результаты и их обсуждение

1. Влияние солей тяжелых металлов на рост микроорганизмов

Для определения диапазона концентрации Cu2+, Zn2+ и Ni2+, в котором культуры жизнеспособны и активно сорбируют металлы, изучались пороги токсического воздействия данных ионов на микроорганизмы (рис. 1-3). Результаты экспериментов приведены в табл. 1.

Рис. 1. Влияние концентрации Cu2+ на АСВ исследуемых культур	Рис. 2. Влияние концентрации Zn2+ на АСВ исследуемых культур
Рис. 3. Влияние концентрации Ni2+ на АСВ исследуемых культур

Табл. 1. Летальные дозы меди, цинка и никеля, вызывающие пятидесяти-

процентное и полное ингибирование роста иловых культур

Культура	Летальные дозы Cu2+, г/л	Летальные дозы Zn2+, г/л	Летальные дозы Ni2+, г/л
LD50	LD100	LD50	LD100	LD50	LD100
F. n	0.2	10	3	-	6	-
F. o	0.3	30	0.1	1	0.2	1
P. g	0.2	3	0.4	10	0.6	10

В общем случае медь токсичнее цинка и никеля, но культура F. o, более устойчивая к меди. Для извлечения цинка и никеля наиболее перспективной является культура F. n, толерантная к сверхвысоким концентрациям данных металлов (свыше 100 г/л).

2. Биосорбция ионов меди

На рис. 4-6 показаны соответственно зависимость сорбционной емкости биомассы от концентрации меди, динамика извлечения металла из раствора и влияние рН среды на сорбционную емкость.

Рис. 4. Влияние концентрации Cu2+ на сорбционную емкость биомассы	Рис. 5. Зависимость количества извлеченной меди от времени контакта биосорбентов с раствором ионов Cu2+
Рис. 6. Влияние рН среды на сорбционную емкость грибной биомассы

Культура P. g сорбирует медь слабее, чем F. n и F. o, сорбционная емкость ее биомассы почти не растет при повышении содержания меди от 0.5 до 2 г/л. Для культур F. n и F. o сорбционная емкость возрастает вплоть до концентрации Cu2+ 2 г/л, далее не изменяясь. Все три культуры являются активными сорбентами меди, но биомассу P. g целесообразно использовать при концентрации Cu2+ менее 0.5 г/л. Наиболее активным биосорбентом меди является культура F. o, накапливающая до 40% металла от сухой массы клетки, что не уступает характеристикам лучших мировых аналогов [16]. Время, необходимое для полного протекания сорбции металла биомассой, варьируется в широких пределах, составляя от 2-3 минут до нескольких часов в зависимости от типа микроорганизма и условий процесса. Для культур F. n и F. o оптимальное время сорбции составляет 3 минуты, для культуры P. g – около 20 минут.

Иногда кислотность среды сильно влияет на процесс биосорбции металлов, например, смесь солей урана, кадмия и меди может быть разделена путем последовательного закисления раствора, содержащего клетки Zoogloea ramigera. При рН 6.5 интенсивно сорбируются ионы меди, при рН 5.5 – ионы кадмия, а при рН 3.5 – урана [11, 15, 16]. Настоящее исследование показало, что в интервале рН от 3 до 8 интенсивность сорбции металла не зависит от кислотности среды. При более кислом рН сорбционная емкость биомассы F. n и F. o резко падает, что может быть полезно при селективном извлечении меди из гальванических стоков. Сорбция наиболее интенсивна при рН 9 вследствие образования малорастворимого гидроксида меди, лучше адсорбируемого клетками, чем ионы Cu2+. При дальнейшем защелачивании среды сорбционная емкость падает по причине щелочного гидролиза биомассы.

3. Биосорбция ионов никеля

Зависимость сорбционной емкости биомассы от концентрации никеля, динамика извлечения металла и влияние уровня рН на сорбционную емкость приведены на рис. 7-9 соответственно.

Рис. 7. Влияние концентрации Ni2+ на сорбционную емкость биомассы	Рис. 8. Зависимость количества извлеченного никеля от времени контакта биосорбентов с раствором ионов Ni2+
Рис. 9. Влияние рН среды на сорбционную емкость грибной биомассы

Исследуемые культуры сорбируют никель на порядок слабее, чем медь. Наиболее эффективным биосорбентом Ni2+ является биомасса P. g, тогда как культура F. n поглощает никель в гораздо меньших количествах (менее 1% от общего числа ионов Ni2+ независимо от их содержания в среде). Вероятно, строение клеточной мембраны, не пропускающей в клетку ионы никеля, делает культуру F. n нечувствительной к действию данного металла. Культуры F. o и P. g сорбируют Ni2+ наиболее эффективно при его концентрации 1-1.5 г/л. Оптимальное время контакта клеток с растворами ионов никеля составляет 5, 10 и 20 минут для культур F. n, F. o и P. g соответственно. Значение рН среды, при котором биосорбция наиболее эффективна, составляет 5-5.5 для культуры F. n, 8-9 – для культуры P. g и от 5 до 8 – для культуры F. o, но на всем интервале значений рН для сорбции ионов никеля выгоднее использовать биомассу культуры P. g.

4. Биосорбция ионов цинка

На рис. 10-12 показаны соответственно зависимость сорбционной емкости биомассы от концентрации цинка, динамика его извлечения и влияние рН среды на сорбционную емкость.

Рис. 10. Влияние концентрации Zn2+ на сорбционную емкость биомассы	Рис. 11. Зависимость количества извлеченного цинка от времени контакта биосорбентов с раствором ионов Zn2+
Рис. 12. Влияние рН среды на сорбционную емкость грибной биомассы

Сорбционная емкость биомассы всех трех культур максимальна при концентрации Zn2+ 1 г/л, при этом культура P. g является наиболее эффективным, а культура F. n – наименее эффективным биосорбентом цинка. Оптимальное время сорбции составляет 5, 10 и 15 минут для культур F. n, F. o и P. g соответственно. Все культуры демонстрируют максимальную интенсивность сорбции Zn2+ при рН 5-5.5.

Заключение

Все три исследованные культуры грибов активного ила перспективны для создания биосорбентов тяжелых металлов, но меди сорбируется на порядок активнее цинка и никеля. Для сорбции меди целесообразнее использовать биомассу культуры F. o, обладающую сорбционной емкостью свыше 400 мг/г по данному металлу. Цинк и никель активнее всего поглощает культура P. g, сорбирующая 35 мг никеля или 70 мг цинка на грамм сухой биомассы. Данные биосорбенты быстро извлекают ионы металлов из растворов – оптимальное время сорбции составляет от 3 минут в случае меди до 15-20 минут при извлечении никеля и цинка. Оптимальное для биосорбции значение рН среды составляет 5.5 для цинка, 7 – для никеля и 9 – для меди. При разных значениях рН и использовании в качестве сорбентов различных культур металлы сорбируются с неодинаковой интенсивностью, поэтому, данные культуры могут быть использовать в качестве селективных сорбентов тяжелых металлов. Постепенно защелачивая стоки гальванического производства, или последовательно внося в растворы гранулы различных грибных сорбентов, можно организовать раздельное извлечение меди, цинка и никеля.

Выводы

Предложен метод извлечения тяжелых металлов из гальванических стоков выделенными из активного ила культурами устойчивых к металлам микромицетов – F. nivale, F. oxysporum и P. glabrum.
Получены биосорбенты, накапливающие свыше 35 мг никеля, 70 мг цинка и 400 мг меди на грамм сухой биомассы, являющиеся дешевой альтернативой ионообменных смол и активи-рованных углей.
Определены оптимальные для сорбции значения кислотности среды (5.5 для Zn2+, 7 для Ni2+ и 9 для Cu2+). Отмечена возможность селективного извлечения ионов металлов из их смеси путем варьирования рН раствора или последовательного использования различных биосорбентов.

Литература

R. B. Salunkhe, S. V. Patil, B. K. Salunke, C. D. Patil, A. M. Sonawane. Studies on silver accumulation and nanoparticle synthesis by Cochliobolus lunatus. Appl. Biochem. Biotechnol. 2011. Vol.165. No.1. P.221-234. A. Hammaini, F. Gonzalez, A. Ballester, M. L. Blazquez, J. A. Munoz. Biosorption of heavy metals by activated sludge and their desorption characteristics. J. Environ. Manage. 2007. Vol.84. No.4. P.419-426. , , Безрукова серебра из разбавленных растворов биосорбентами. Изв. вузов. Цветная металлургия. 2006. No.2. С.32-40. N. R. Panyala, E. M. Peсa-Mйndez, J. Havel. Silver or silver nanoparticles: a hazardous threat to the environment and human health? J. Appl. Biomed. 2008. No.6. P.117-129. V. K. Sharma, R. A. Yngard, Y. Lin. Silver nanoparticles: Green synthesis and their antimicrobial activities. Adv. Colloid Interface Sci. 2009. Vol.145. No.1-2. P.83-96. A. Seaton, L. Tran, R. Aitken, K. Donaldson. Nanoparticles, human health hazard and regulation. J. R. Soc. Interface. 2010. Vol.7(Suppl 1)  P. S119-S129. E. Fourest, C. Canal, J. C. Roux. Improvement of heavy metal biosorption by mycelial dead biomasses (Rhizopus arrhizus, Mucor miehei and Penicillium chrysogenum): pH control and cationic activation. FEMS Microbiol. Rev. 1994. Vol.14. No.4. P.325-332. , , Стрижко процессом биосорбционного извлечения серебра. М.: Типография . 2006. 61с. M. Tuzen, M. Soylak. Column solid-phase extraction of nickel and silver in environmental samples prior to their flame atomic absorption spectrometric determinations. J. Hazard. Mater. 2009. Vol.164. No.2-3. P.1428-1432. , , Каравайко серебра микромицетами. Микробиология. 1999. №2. С.172-8. L. Li, Q. Hu, J. Zeng, H. Qi, G. Zhuang. Resistance and biosorption mechanism of silver ions by Bacillus cereus biomass. J. Environ. Sci. 2011. Vol.23. No.1. P.108-111. P. Simmons, I. Singleton. A method to increase silver biosorption by an industrial strain of Saccharomyces cerevisiae. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1996. Vol.45. No.1-2. P.278-285. , Лыков возможности использования дрожжей Saccharomyces cerevisiae в качестве биосорбента тяжелых металлов из промышленных сточных вод. Вестник. 2008. №1. С.110-9. F. Latudi. La precipitation des metaux lourds. Biofutur. 1990. Vol.93. P.36-7. H. Zhang, Q. Li, H. Wang, n, Y. Lu, N. He. Accumulation of silver(I) ion and diamine silver complex by Aeromonas SH10 biomass. Appl. Biochem. Biotechnol. 2007. Vol.143. No.1. P.54-62. , Росси Дж., Авакян металлов. М.: Центр международных проектов. 1989.

In the English version of this article, the Reference Object Identifier – ROI: jbc-02/17-50-5-57

Heavy metal biosorbents based on activated sludge micromycetes

© Dmitry V. Tyupa,1* Sergei V. Kalenov,2+ and Nikolay yasov2

1 IBC “Generium”. Vladimirskaya St., 14. Volginsky Village. Petushinski District, 601125. Russia.

Phone: [phone]. E-mail: *****@***ru

2 Department of Biotechnology. Faculty of Biotechnology and Industrial Ecology, Mendeleyev University

of Chemical Technology of Russia. Miusskaya Sq., 9. Moscow, 125047. Russia.

Phone: [phone]. E-mail: *****@***ru

___________________________________

*Supervising author; +Corresponding author

Keywords: biosorption, heavy metals, sorption capacity, activated sludge, copper, nickel, zinc.

Abstract

The extraction of heavy metals from the waste water of the galvanic industry with biosorbents is considered to be a more economical method than using traditional sorbents such as ion-exchange resins and activated carbons. In this paper we studied the biosorption of copper, zinc and nickel ions by the biomass of cultures of mold fungi isolated from active sludge of water treatment plants – F. nivale, F. oxysporum and P. glabrum. Selected microorganisms spontaneously form strong biomass granules, resistant to high doses of heavy metals, which allows them to sorb metals in large quantities. All three studied fungal cultures appeared to be promising for the creation of heavy metal biosorbents, however, the sorption intensity of copper ions is an order of magnitude higher than that for zinc and nickel. For the purpose of copper sorption, it is most expedient to use the biomass of the F. oxysporum culture, which has a sorption capacity of more than 400 mg/g for this metal. Zinc and nickel ions most actively absorb the biomass of the P. glabrum culture, which sorbs 35 mg of nickel or 70 mg of zinc per gram of dry biomass.

The biosorbents obtained in the course of the investigation quickly recover metal ions from solutions: the optimum sorption time is from 3 minutes in the case of copper to 15-20 minutes when the nickel and zinc ions are extracted. The values of the acidity of the medium, optimal for effective sorption, are determined. Zinc ions are most actively sorbed at pH 5.5, while nickel and copper ions fungi biomass absorbs most efficiently at pH 7 and 9, respectively. It was noted that at different pH values of the medium and using various fungal cultures as sorbents, the metal ions are sorbed with unequal intensity. Therefore, these cultures can be used as selective sorbents of heavy metals. Gradually alkalizing effluents of galvanic production, or sequentially adding granules of various fungal sorbents to solutions, it is possible to organize separate extraction of copper, zinc and nickel ions.