ДВА ТИПА ТКАНЕИНЖЕНЕРНЫХ ЭКВИВАЛЕНТА ХРЯЩЕВОЙ ТКАНИ НА ОСНОВЕ ХОНДРОЦИТОВ ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В РЕКОНСТРУКТИВНОЙ ХИРУРГИИ
1,2, 3, 4, 1
1ФГБУН ИБР РАН, 2 ГБОУ ВПО РНИМУ им. Минздрава России, 3 ФГБУ ГНЦ ФМБЦ им. ФМБА России, 4 ФГБУ «МНИИ Глазных болезней им. Гельмгольца» Минздрава России
*****@***ru
Приводятся результаты исследований двух типов тканеинженерных эквивалентов хрящевой ткани: на основе коллагенового геля в качестве матрицы-носителя хондроцитов и без использования подложки. Гистологические и иммуногистохимические исследования показали гистотипическое подобие созданных эквивалентов хрящевой ткани. На модели кератэктомии у кроликов показано, что хрящевой эквивалент на основе коллагенового геля сохраняется в тканях роговицы как минимум на 3 месяца после трансплантации. На модели дефекта хрящевой ткани ушной раковины у кроликов показано, что хрящевой эквивалент без подложки способен встраиваться в структуру поврежденной ткани и восполнять дефект.
Зрелая хрящевая ткань обладает низким регенеративным потенциалом, поскольку плотный внеклеточный матрикс препятствует пролиферации клеток в количестве, необходимом для восполнения повреждённого участка ткани. Несмотря на широкий спектр способов восстановления хрящевой ткани (пластика местными тканями, применение имплантатов и эспандеров, протезов, биополимеров и т. д.) проблема хирургической реабилитации пациентов с врожденными или приобретенными дефектами верхних дыхательных путей остается актуальной [1]. В офтальмологии для предупреждения развития протрузии кератопротеза необходимо усилить прочностные свойства бельма. Для этих целей используют эпикорнеальное укрепление слизистой оболочкой полости рта [2], аутохрящем ушной раковины [3], интрастромальное укрепление бельма твердой мозговой оболочкой [4]. Учитывая незаменимость кератопротезирования при тяжелых ожогах глаз, актуальна задача по созданию тканевого эквивалента, способного выполнять функции механической опоры при укреплении бельм роговицы. Цель работы: разработать эквивалент хрящевой ткани и на экспериментальной модели кератэктомии и дефекта хрящевой ткани ушной раковины исследовать его поведение при трансплантации в область дефекта.
Методы. В работе использовали культуры аутологичных хондроцитов кролика. Разработано 2 протокола создания хрящевого эквивалента (ХЭ) – на основе коллагенового геля и без подложки. Проводили сравнительный анализ двух структур. Для достижения клеточного натяжения в конструкции была подобрана концентрация клеток 2х106 кл/мл коллагенового геля. Для создания ХЭ без подложки на пластик хондроциты высевали в высокой плотности (105 кл/см2) и культивировали в дальнейшем без пересевов в течение 3 недель. Смену среды осуществляли каждые 2 суток. За сутки до трансплантации ХЭ переводили на среду без сыворотки. В дефект хрящевой ткани ушной раковины трансплантировали ХЭ без подложки, а также ХЭ на основе коллагенового геля. В контроле дефект оставался незаполненным. Гистологический и иммуногистохимический анализ проводили через 8 недель. В несквозной дефект роговицы трансплантировали ХЭ на основе коллагенового геля Ш 8 мм, гистологический анализ роговиц проводили через 90 суток после трансплантации. ХЭ исследовали на экспрессию специфических для хрящевой ткани маркеров с помощью первичных антител против агрекана, хрящевого протеогликана, коллагена 2 типа, хрящевого олигомерного матриксного белка (СОМР).
Результаты. Показано, ХЭ как на основе коллагенового геля, так и без подложки обладают гистотипическим подобием нативному хрящу (рис. 1, 2). Метахромазия толуидинового синего указывает на наличие гликозоаминогликанов во внеклеточном матриксе. С помощью иммуногистохимического анализа ХЭ на основе коллагенового геля выявлено появление в периферической зоне эквивалента экспрессии специфических для хряща агрекана, хрящевого протеогликана, коллагена 2 типа. Экспрессия хрящевого олигомерного матриксного белка (СОМР) выявлена в единичных клетках (рис. 1). В случае ХЭ без подложки экспрессия специфических маркеров выявлено по всей толще эквивалента (рис. 2).
Рис.1. Гистологический и иммуногистохимический анализ хрящевого эквивалента на основе коллагенового геля.
Рис. 2. Гистологический и иммуногистохимический анализ хрящевого эквивалента без подложки.
Для исследования возможности применения ХЭ в офтальмологии с целью укрепления бельма роговицы перед кератопротезированием проводили трансплантацию аутологичного ХЭ на основе коллагенового геля в центральный несквозной дефект роговицы. Через 90 суток после трансплантации в 9 случаях из 10 в области трансплантации выявлено приживление ХЭ (рис. 3). В 1 случае наблюдали мощную воспалительную реакцию, лизис трансплантата.
Для исследования возможности применения ХЭ в реконструктивной хирургии проводили трансплантацию ХЭ без подложки и на основе коллагенового геля в критический дефект хрящевой ткани ушной раковины кролика. Размер дефекта составил не менее 12х10 мм. Показано, что ХЭ без подложки встраивается в структуру поврежденной ткани и восполняет дефект. ХЭ на основе коллагенового геля также сохраняется в области дефекта, дефект заполнен хрящевой тканью по типу волокнистой хрящевой ткани.
Таким образом, показано гистотипическое подобие созданных эквивалентов хрящевой ткани. На модели кератэктомии показана способность ХЭ на основе коллагенового геля сохраняется в тканях роговицы как минимум на 3 месяца после трансплантации. На модели дефекта хрящевой ткани ушной раковины у кроликов показана способность ХЭ без подложки встраиваться в структуру поврежденной ткани и восполнять дефект.
Работа поддержана грантом РФФИ № 13-04-12052 офи-м
, , Ребрикова . 2013, №1, С. 73-79. Мороз . . д-ра мед. наук, М., 1987, -312с. Ченцова . канд. мед. наук. - М., 1984.- 167 стр. , , Непомящая , 2001,- 272 с.
TWO TYPES OF TISSUE-ENGINEERED CARTILAGE EQUIVALENT ON THE BASIS OF CHONDROCYTES FOR USE IN RECONSTRUCTIVE SURGERY
E. V. Kiseleva, E. V. Batukhtina, T. A. Kanukova, V. V. Terskikh
N. K. Koltzov Institute of Developmental Biology RAS
The experimental results of two types of tissue-engineered cartilage equivalents: based on collagen gel as a scaffold for chondrocytes and without the scaffold. Histological and immunohistochemical studies have shown the likeness created equivalents to native cartilage. On the model of keratectomy in rabbits it was shown that the cartilage equivalent based on collagen gel stored in the cornea tissues at least 3 months after transplantation. On the model of cartilage defect of the ear in rabbits it was shown that cartilage equivalent without the scaffold is able to be integrated into the damaged tissue structure and fill the defect.
