Применение выделенных из почвы микроорганизмов для переработки целлюлозы

УДК 579:628

ПРИМЕНЕНИЕ ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ПОЧВЫ МИКРООРГАНИЗМОВ ДЛЯ ПЕРЕРАБОТКИ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ

ВолгГТУ

Научный руководитель – профессор

Большинство микроорганизмов не способны использовать в качестве источника питания такой сложный биополимер как целлюлозу. В связи с этим данное исследование направленно на выделение штамма, который может перерабатывать целлюлозу до моносахаридов с последующим использованием их для культивирования микроорганизмов.

Целью проведенной работы являлось выделение из почвы микроорганизмов, способных перерабатывать целлюлозу, и изучение основных свойств выделенных штаммов.

Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи:

- приготовление питательной среды для выделения целлюлозоразлагающих штаммов;

- выделение из образца почвы чистых культур вышеуказанных микроорганизмов;

- изучение их культуральных и морфологических свойств.

Выделение микроорганизмов производили на экспериментальной полусинтетической среде, содержащей воду (200 мл), пептон (0,2 г) минеральные соли (г): NH4NO3 – 0,4; KH2PO4 – 0,2; СаCl2 – 0,06; MgSO4 – 0,01; CaCO3 – 1. Полученную смесь кипятили в течение 1 мин, постоянно перемешивая, и стерилизовали автоклавированием при 1 атм в течение 15 мин.

В широкогорлую колбу со стерилизованной полусинтетической средой внесли 1 г почвы, 1 г фильтровальной бумаги и 1 г ваты. Колбу поместили в термостат на 10 суток при температуре 37°C. По истечении периода инкубации с помощью бактериальной петли выделили из содержимого колбы кусочек фильтровальной бумаги и произвели посев на раннее приготовленную по следующему рецепту плотную питательную среду: 1 г мелкокристаллической целлюлозы, 6 г агар-агара, NH4NO3 – 0,3 г, KH2PO4 – 0,2 г, MgSO4 – 0,05 г; NaCl – 5 г, FeSO4 – 0,01 г растворяем в 200 мл дистиллированной воды, кипятим в течение 1 мин и разливаем в чашки Петри. Через сутки на питательной среде наблюдался сплошной рост колонии.

Для изучения морфологических свойств выделенных штаммов использовался метод окраски по Грамму и микроскопирование в проходящем свете оптического микроскопа МЛ-1 (производства ЛОМО). Техника окраски по грамму заключалась в следующем. На предметное стекло наносили каплю дистиллированной воды, брали тонкий мазок микробной массы и вносили в эту каплю. Мазки высушивали, фиксировали и окрашивали в течение 2 мин феноловым раствором кристаллического фиолетового. Сливали краситель, наносили на него на 2 мин раствор Люголя. Препарат, не промывая водой, обрабатывали, непрерывно покачивая, 96% этиловым спиртом в течение 15-20 сек. Промыв водой, препарат окрашивали фуксином Пфейфера в течение 1 мин, промывали водой, высушивали, промокая фильтровальной бумагой, и проводили микроскопирование.

Результат окраски и микроскопирования показал, что выделенный из почвы штамм относится к грамположительным бактериям.

Для изучения культуральных свойств приготовили взвесь суточной культуры, соответствующую концентрации -  стандарт мутности 10. Полученную взвесь семикратно раститровывали в 4,5 мл 0,89% NaCl и высевали в объеме 0,1 мл на полусинтетическую среду для получения единичных колоний.

Изучение культуральных свойств позволило выявить следующие характеристики:

- колонии точечные ( диаметр меньше 1 мм);

-внутри колонии находится пузырек, от которого отходят грибоподобные гифы;

- рельеф каплеобразный;

- поверхность блестящая с глянцем;

- цвет молочно-мутный, похожий на опал;

-  консистенция пастообразная, легко снимающаяся и размывающаяся по поверхности среды наподобие сливочного масла.

Для изучения способности выделенного штамма разлагать целлюлозу до моносахаров была приготовлена жидкая питательная среда состава: NH4NO3 – 0,4 г, MgSO4 – 0,01 г, KH2PO4 – 0,2 г, CaCl2 – 0,006 г, вода – 200 г. В отобранные в пробирку 30 мл данной среды была внесена целлюлоза (1% объем.). Полученная среда была обработана ультразвуком в течение 20 мин для измельчения целлюлозы. В две пробирки разлили по 3 мл питательной среды с целлюлозой. В одну пробирку внесли 0,1 мл миллиардной взвеси суточной культуры выделенного штамма. Другая пробирка использовалась в качестве контрольной. Пробирки поставили в термостат на 2 суток при 37оС. Через 48 ч периода инкубации пробирки были извлечены из термостата. Визуально наблюдалась мутность содержимого в пробирке с засеянной культурой. В контрольной пробирке среда была прозрачной. 

Для подсчета концентрации микроорганизмов в пробирке полученную взвесь пятикратно раститровывали в 0,9 мл 0,89% NaCl и высевали в объеме 0,2 мл на полусинтетическую среду с трехкратным повторением. Засеянные чашки на сутки поставили в термостат. Через сутки снимались результаты. На первых четырех чашках (по степени раститровки – от меньшего к большему разведению) наблюдался сплошной рост культуры. На пятых чашках также посчитаны колонии: 1) 297; 2) 325; 3) 305. Соответственно посчитана концентрация микробных клеток, выросших на питательной среде с целлюлозой, которая составила 1,55.108 м. к/мл.

Результаты указывают о росте выделенных из почвы микроорганизмов в среде с источником углерода – целлюлозой. Изучаемый штамм способен перерабатывать целлюлозу. Данные результаты указывают на то, что выделенный штамм может использоваться для переработки отходов, содержащих целлюлозу.

Список литературы:

Лабинская по медицинской микробиологии. Общая и санитарная микробиология. /Под ред. , . – М.: БИНОМ, 2008. - 1080с.