Практическое занятие №3

Практическое занятие №3.

2.Тема:Иммунодефициты. Методы оценки иммунного статуса. Иммунотерапия.

3. Цель: ознакомиться с формами и механизмами иммунодефицитов, умение оценить результаты исследования  иммунного статуса и овладеть принципами иммунотерапии.

4. Вопросы для рассмотрения:

1. Иммунодефициты.  Классификация.

2. Врожденные иммунодефициты (классификация, клинические варианты, диагностика, лечебная тактика). Генетика иммунодефицитов, особенности наследования.

3. Вторичная иммунологическая недостаточность (ВИН) – классификация, этиология, клинические варианты, диагностика и лечение.

4. Патогенез развития иммунодефицита при ВИЧ-инфекции.

5. Иммунный статус. Методы оценки иммунного статуса. Оценка иммунограмм.

6. Иммунотерапия. Иммунотропные препараты (классификация).

5. Основные понятия темы.

Иммунодефицит. Первичные (врожденные) иммунодефицитные состояния. Недостаточность фагоцитоза. Недостаточность комплемента. Недостаточность гуморального иммунитета. Недостаточность клеточного иммунитета. Комбинированные иммунодефициты.

Хроническая гранулематозная болезнь. Дефекты адгезии лейкоцитов (LAD). Дефицит миелопероксидазы. Дефекты системы комплемента. Тяжелая комбинированная иммунная недостаточность. Х-сцепленная тяжелая комбинированная иммунная недостаточность. Дефицит б-цепи рецептора IL-7. Дефицит RAG-1/RAG-2. Дефицит молекул MHC-II. Дефицит CD4. Синдром Ди Джорджи. Х-сцепленная агаммаглобулинемия Брутона. Гипер-IgM-cиндром.

Вторичная иммунологическая недостаточность. физиологические иммунодефициты. Иммунодефицит при ВИЧ-инфекции.

Иммунный статус. Основные показатели. Тесты 1 и 2 уровня. Типы иммунограмм (инфекционно-воспалительный, аллергический, лимфопролиферативный). Методы иммунофенотипирования лимфоцитов. НСТ-тест.

Иммунотерапия. Иммуностимуляторы. Иммунодепрессанты.

Иммуномодуляторы – иммунотропные препараты,  восстанавливающие функции иммунной системы путем ее нормализации (иммунокорректоры), изменяющие активность иммунной системы в сторону повышения  (иммуностимуляторы) или понижения (иммунодепрессанты) ее активности

Для нормализации или повышения функции иммунной системы при иммунодефицитных стояниях применяют иммуностимуляторы,  для подавления функций иммунной системы, при иммунопатологии и трансплантации органов и тканей - иммунодепрессанты. Иммуномодуляторы могут обладать бимодальном действием оказывая, в зависимости от дозы и времени введения, иммуномодулирующий или иммунодепрессивныи эффект

Иммуномодуляторы влияют на:

процессы пролиферации и дифференцировки клеток предшественников; транспорт  иимунокомпетентных клеток; процессы распознавания и презентации антигена, на пролиферацию клона активированных клеток; функциональную активность ИК (секрецию цитокинов); экспрессию цитокиновых R (на пути передачи сигнала от R к ядру клетки, на факторы транскрипции)

6. Рекомендуемая литература:

Ковальчук иммунология и аллергология с основами общей иммунологии: учебник. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011. – 640 с. Ярилин М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010. - 752 c. Хайдуков анализ в клинической микробиологии/  , , //Екатеринбург: УрО РАН,.-2011.-220 с. Иммуномодуляторы и вакцинация / под ред. , .- М.:  4Мпресс, 2013.-272 с. Хаитов М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011.

7. Самостоятельная работа студентов к занятию.

ПЛАН САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

1. ознакомиться с тестами 1-го и 2-го уровня для оценки иммунного статуса (реакция розеткообразования, реакция бласттрансформации, показатель фагоцитоза, НСТ-тест (Работа 1);

2. ознакомиться с иммунограммами (Работа 2);

САМОСТОЯТЕЛЬНЫЕ ПРАКТИЧЕСКИЕ РАБОТЫ

Работа 1. Овладеть методикой оценки тестов 1-го и 2-го уровня.

Изучите демонстрационные препараты:

1. Е-розеткообразующая клетка,

2. Фагоцитоз стафилококков.

3. Реакция бласттрансформации лимфоцитов

4. НСТ-тест

5. Чашка с реакцией иммунопреципитации  для обнаружения IgG  (по Манчини).

Познакомьтесь с методиками некоторых тестов для оценки иммунного статуса.

Подсчет количества Т - и В-лимфоцитов в реакциях Е - и ЕАС-розеткообразования (Е-РОК, ЕАС-РОК)

Принцип.

Поверхностные рецепторы, специфичные для различных субпопуляций лимфоцитов, проявляются, связывая эритроциты, нативные или нагруженные антителами к этим рецепторам. Эритроциты образуют с поверхностью лимфоцита фигуру розетки. За розетку принимают лимфоцит, присоединивший 3-5 эритроцитов.

Метод определения Т-лимфоцитов методом спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана (Е-РОК). Т-лимфоциты имеют рецепторы для эритроцитов барана, которые выступают, таким образом, специфическим маркером для их распознавания (Е-РОК: Erythrocyte — розеткообразующие клетки).

К лимфоцитам, выделенным из венозной крови с помощью центрифугирования и отмытым буфером, добавляют равный объем 0,5 % взвеси эритроцитов барана. Соотношение эритроциты: лимфоциты не должно превышать 50:1. Инкубируют смесь в термостате 37 °С в течение 10 мин. Подсчет проводят под световым микроскопом с использованием счетной камеры.

Метод определения В-клеток методом розеткообразования с эритроцитами барана в системе ЕАС. Метод основан на  способности В-клеток образовывать розетки с бараньими эритроцитами, нагруженными антителами в среде комплемента благодаря наличию  Fc, и Сз рецепторов у В-лимфоцитов.

К лимфоцитам, выделенным из венозной крови с помощью центрифугирования и отмытым буфером, добавляют равный объем взвеси бараньих эритроцитов нагруженных антителами и комплементом (ЕАС). Инкубируют смесь в термостате 37 °С в течение 10 мин. Подсчет проводят под световым микроскопом с использованием счетной камеры.

Определение фагоцитарной активности сегментоядерных нейтрофилов.

Принцип: полиморфноядерные лейкоциты, моноциты периферической крови способны связывать на своей поверхности, поглощать и переваривать микробную тест-культуру (стафилококк).

Методика: к венозной гепаринизированной крови добавляется равный объем микробной взвеси (суточная культура S. aureus) и инкубируется в термостате 30 мин. Лейкоциты отделяют от жидкости центрифгированием, фиксируют, окрашивают и делают тонкий мазок. С использованием светового микроскопа производят подсчет фагоцитарных клеток с определением фагоцитарного показатель (процент клеток, участвующих в фагоцитозе) и фагоцитарного индекса (число микробов, захваченных одной клеткой).

Реакция бласттрансформации с использованием митогена

Принцип метода основан на способности лимфоцитов к трансформации в бласты и размножению под воздействием антигенов, аллергенов и митогенов.

Методика: лимфоциты, выделенные из пробы крови пациента, обрабатывают специальными веществами – стимуляторами бласттрансформации. Для бласттрансформации T-лимфоцитов используют фитогемагглютинин (ФГА),  для бласттрансформации B-лимфоцитов – липополисахарид. При этом они претерпевают превращение обратно в бласты (крупные клетки с ядром, занимающим практически весь объем клетки). Результат оценивается микроскопически.

Тест восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест)

Принцип: НСТ тест позволяет оценить состояние кислородзависимого механизма бактерицидности фагоцитов (гранулоцитов) крови in vitro. В основе метода лежит способность нейтрофилов поглощать НСТ и восстанавливать его в гранулы диформазана. Восстановление поглощённого фагоцитом растворимого красителя НСТ в нерастворимый диформазан происходит под влиянием супероксиданиона (предназначен для внутриклеточного уничтожения инфекционного агента после его поглощения), образующегося в НАДФ-Н-оксидазной реакции «кислородного взрыва» в активированных нейтрофилах.

Метод: в одну лунку с выделенными омытыми лейкоцитами вносят раствор НСТ (спонтанный НСТ-тест), в другую - раствор НСТ и зимозан (стимулированный НСТ-тест). После инкубации в течение 30 мин делают мазки и подсчитывают на световом микроскопе процент нейтрофилов, содержащих гранулы диформазана (серые «глыбки»). В норме у взрослых количество НСТ-положительных нейтрофилов составляет до 10%.

5. Количественное определение субпопуляций лимфоцитов с использованием моноклональных антител (иммунофенотипирование лимфоцитов)

Принцип: флюоресцентно меченые моноклональные антитела связываются с поверхностными антигенами лимфоцитов (CD – маркеры клеточной дифференцировки), что учитывается с использованием люминесцентного микроскопа.

Методика: к взвеси лимфоцитов, выделенных из венозной крови, добавляют моноклональные антитела (например, в первой лунке планшета: лимфоциты + АТ к CD-3, во второй лунке: лимфоциты + АТ к CD-4,  в третьей лунке: лимфоциты + АТ к CD-8, в четвертой - лимфоциты + АТ к CD-19). После отмывки к лимфоцитам добавляют антиглобулиновую сыворотку, меченную флюорохромом. С использованием люминесцентного микроскопа определяют процентное содержание определенных субпопуляций лимфоцитов:  CD-3, CD-4, CD-8, CD-19 и т. д. (по количеству светящихся клеток).

6. Количественное определение циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК)

Принцип: в основе метода лежит селективная преципитация комплексов антиген-антитело в растворе полиэтиленгликоля (ПЭГ) с последующим определением оптической плотности на фотометре.

Методика: к сывороке крови, разведенной в буфере, добавляют ПЭГ. После инкубации в течение 1 ч, измеряют оптическую плотность смеси по сравнению с контролем (без добавления ПЭГ).

Протокол  исследования:

Цель ….

Рисунки демонстрационных препаратов

Рис. 1.  Е-розеткообразующая клетка (Е-РОК) 

Рис. 2.  Фагоцитоз стафилококков (мазок крови)

Рис. 3. Реакция бласттрансформации лимфоцитов

Рис. 4. НСТ-тест

Рис. 5. Чашка с реакцией иммунопреципитации  для обнаружения IgG (по Манчини).

  Рис. 1.  Е-розеткообразующая клетка  Рис. 2.  Фагоцитоз стафилококков 

  (Е-РОК)  (мазок крови)

Рис. 3. Реакция бласттрансформации лимфоцитов

Рис. 4. НСТ-тест 

       

           

Рис. 3. Чашка с реакцией иммунопреципитации  для обнаружения IgG

(по Манчини)

Работа 2. Овладеть навыком оценки иммунограмм.

Оцените предложенные иммунограммы пациентов в соответствии с возрастной нормой. Дайте количественную оценку иммунограммы: СИД, ОППОН, ФРИС. Сделайте заключение о характере нарушений с выделением ведущего синдрома иммунопатологии (инфекционно-воспалительного, аллергического, аутоиммунного или лимфопролиферативного). Иммунограммы предоставлены проблемной лабораторией по изучению механизмов естественного иммунитета ОрГМА.

Протокол  исследования:

Цель ….

ПОКАЗАТЕЛЬ	В НОРМЕ	У ОБСЛЕДУЕ-МОГО	наличие и характер отклонения
лейкоциты (109/л)
лимфоциты (%)
лимфоциты (109/л)
СD3+лимфоциты (%)
СD3+лимфоциты (109/л)
CD19+лимфоциты (%)
СD19+лимфоциты (109/л)
CD4+ лимфоциты (%)
CD8+лимфоциты (%)
палочкоядерные нейтрофилы %
сегментоядерные нейтрофилы %
моноциты %
эозинофилы %
базофилы %
Фагоцитарная показатель %
Фагоцитарный индекс (усл. е.)
НСТ спонтанный %
НСТ стимулированный %
ЦИК (ед. ОП)
IgA, г/л
IgM, г/л
IgG, г/л
IgЕ, МЕ/мл

Заключение: Иммунограмма нейтрофильного/лимфоцитарного типа с лейкоцитозом/лимфоцитозом/нейтрофилезом/эозинофилией (нужное выбрать) с увеличением количества:….(перечислить), с уменьшением количества:…. (перечислить).

ОППОН составляет …… % (…….степень).

ФРИС: …………………………………….

Письменные задания для самостоятельной работы

Во внеучебное время

Написать классификацию иммунотропных препаратов:.

по химическому строению, по точке приложения действия.