УДК 543.645.6, ББК 102.24.46; 2.28.3; 5.52.6.
МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ БЕЛКА В ГРИППОЗНОЙ СПЛИТ ВАКЦИНЕ В ПРИСУТСТВИИ МЕШАЮЩИХ СОЕДИНЕНИЙ
СО СПЕЦИАЛЬНОЙ ПРОБОПОДГОТОВКОЙ,
ВКЛЮЧАЮЩЕЙ РАЗВЕДЕНИЕ, ТЕМПЕРАТУРНУЮ ОБРАБОТКУ/ПРЕЦИПИТАЦИЮ, ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ
, ,
Филиал ФГУП «НПО «Микроген» Минздрава России в г. Уфа «Иммунопрепарат», г. Уфа
Аннотация: Разработан модифицированный бицинхониновый метод определения белка в вакцине гриппозной инактивированной расщепленной, включающий специальную пробоподготовку (разведение, температурная обработка/преципитация, центрифугирование), снимающую влияние мешающих соединений – глицина и твина 80. Полученные результаты подтверждены независимым методом определения белка - электрофорезом в полиакриламидном геле с додецил сульфатом натрия, а также при сравнении с зарубежными расщепленными вакцинами. Разработанный метод удовлетворяет валидационным требованиям к воспроизводимости, повторяемости, правильности, линейности.
Ключевые слова: вакцина гриппозная инактивированная расщепленная, сплит вакцина, общий белок, бицинхониновый метод, мешающие соединения, пробоподготовка.
Введение
Согласно международным требованиям метод определения белка относится к обязательным методам контроля гриппозных вакцин. Повышенное внимание к данному методу объясняется сложностью получения достоверных результатов в присутствии различных вспомогательные веществ, которые используются в технологии производства, как на стадии расщепления цельного вируса, так и на стадии формулирования конечной вакцины.
В соответствии с монографией Европейской Фармакопеи (ЕФ) на вакцину гриппозную инактивированную расщепленную (гриппозная вакцина) [1] и рекомендациями Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) [2, 3] установлены только верхние нормы содержания белка. В одной дозе трехвалентной вакцины (0,5 мл) содержание белка не должно превышать 300 мкг (600 мкг/мл) или 100 мкг на каждый вирусный штамм. По отношению к общему содержанию гемагглютинина допускается шестикратное превышение белка.
Таблица 1 – Сравнительный анализ различных методов определения белка [9]
Наименование метода | Принцип | Чувствительность | Преимущества | Примечания | Основные мешающие соединения | Требуемое время | Необходимое количество белка (мг) |
Кьельдаля | Кислотно-щелочное титрование общего азота в образце | Низкая | Надежный | Трудоемкий | Небелковый азот | Несколько часов | |
УФ поглощение (280 нм) | Поглощение остатков тирозина и триптофана при 280 нм | 0,2-2 мг/мл | Прямой, быстрый, неразрушающий | Зависит от состава белка (триптофан, тирозин и фенилаланин) | Нуктеиновые кислоты и материалы, поглощающие в УФ | Мгновенно | 0,05-2 |
Биуретовый | Пурпурно-фиолетовый комплекс белка с медью | Низкая | Независимый от состава белка | Минимальное изменение цвета в зависимости от природы белка. Реактив меди реагирует с пептидной цепью | Трис-буфер, ионы аммония, сахароза, первичные амины, глицерин | Быстро (5 мин.) | 0,05-5 |
Лоури | Синий комплекс меди с белком | 5-100 мкг/мл | Высоко-чувствительный | Зависит от состава белка из-за вовлечения остатков тирозина и триптофана в комплексообразование | Буферные растворы, содержащие азот, фосфаты, ионы аммония детергенты, сахара, хелаты, редуцирующие агенты | 40 мин. | 0,05-5 |
Брэдфорда | Голубой комплекс красителя (Кумасси голубой G-250) с белком | 25-200 мкг/мл | Быстрый, высокочувствительный, мало мешающих соединений | Очень зависит от состава белка | Некоторые детергенты (Додецилсульфат натрия, Тритон Х-100) | 10 мин. | 0,01-0,05 |
Бицинхониновый | Разновидность метода Лоури: комплекс бицинхониновой кислоты с Cu+1 | Стандартный протокол: 20-2000 мкг/мл Расширенный протокол: 5-250 мкг/мл | Один реагент. Стабильный конечный продукт. Меньше мешающих соединений, чем в методе Лоури | Зависит от состава белка | ЭДТА, глюкоза, редуцирующие агенты, ионы аммония | 40 мин., 2 ч или в течение ночи | 0,02-0,12 (стандартный протокол) 0,005-0,025 (расширенный протокол) |
Таблица 2 – Сравнение различных методов определения белка по диапазону применения и минимальному объему пробы [10]
Наименование метода | Объем пробы | Диапазон применения, мкг/мл |
Биуретовый | 1 мл | 1000 - 10000 |
Хартри-Лоури | 1 мл | 100 - 600 |
Бицинхониновый | 100 мкл | 200 – 1000 |
Нингидринный | 1 мл | 20 - 50 |
Поглощение в УФ | 1 мл | 30 – 300 |
Связывание с Кумасси голубым | 100 – 200 мкл | 60 – 300 |
Сухой остаток | 0,5 – 10 мл | 2000 – 10000 |
Для определения белка в гриппозных вакцинах, по данным многочисленных публикаций [4, 5, 6, 7, 8], используются два основных метода – это бицинхониновый метод и Лоури. Согласно обзорным сравнительным таблицам 1 и 2 [9, 10] бицинхониновый метод (БХМ) имеет ряд преимуществ над методом Лоури по чувствительности, простоте, удобству (используется один реагент), минимальному объему пробы (100 мкл), возможности присутствия детергентов. Следовательно, БХМ имеет более высокий потенциал возможности использования в качестве тестового метода для контроля содержания белка в гриппозных вакцинах. По данным представленным в таблице 1, определению белка по методу Лоури мешают детергенты, фосфаты, сахара [9], которые, как правило, присутствуют практически во всех гриппозных вакцинах и/или их полуфабрикатах. Для метода Лоури из-за присутствия детергентов характерно появление мешающих преципитатов, которые могут приводить к завышению истинных результатов, а при наличии стадии предварительного осаждения - к их занижению. В качестве стабилизатора в большинстве гриппозных вакцин используется детергент твин 80. Для метода Лоури не ингибирующий уровень твина 80 составляет 0,031%, что, однако, не соответствует требованиям проекта ФСП на вакцину «Микросплит», разрабатываемую ФГУП «НПО «Микроген» Минздрава России, не более 1500 мкг/мл или не более 0,15%. Согласно технического руководства Pierce [11], в отличие от метода Лоури, БХМ относится к детергент-совместимым методам (до 5%), его резистентность к твину 80 примерно в 161 раз выше, по сравнению с методом Лоури. В технологии получения вакцины «Микросплит» предусмотрено также использование второго детергента, солюбилизирующего агента − N-лауроилсаркозината натрия, с допустимым остаточным содержанием не более 200 мкг/мл согласно проекту ФСП. Помимо этого в состав вакцины «Микросплит» также входит глицин (аминоуксусная кислота) с содержанием от 19,2 до 28,8 мг/мл, который, согласно того же технического руководства [11] также относится к мешающим соединениям для БХМ с допустимым уровнем – 1 мМ (0,0075%). К сожалению, в данном случае резистентность БХМ по сравнению с методом Лоури ниже в 100 раз, однако эта проблема может быть решена за счет осаждения белка. Помимо указанных вспомогательных веществ в состав вакцины «Микросплит» в качестве стабилизатора входит человеческий сывороточный альбумин (ЧСА) в концентрации 150 мкг/мл. Известно, что ЧСА обладает высокой сорбционной активностью по отношению ко многим соединениям, а также отличается особыми условиями преципитации, что может внести свой вклад в проблему определения белка в гриппозных вакцинах. С учетом выше изложенного в качестве тестового метода для определения белка в гриппозной сплит вакцине нами был выбран БХМ.
Цель
Разработать модифицированный бицинхониновый метод определения белка в гриппозной сплит вакцине «Микросплит», позволяющий исключить влияние мешающих соединений.
Задачи
1. Изучить возможность нивелирования влияния мешающих соединений за счет применения известных решений – разведения, осаждения, а при их недостаточности, температурной обработки.
2. Провести сравнение выбранного метода определения белка с альтернативным методом электорофореза в полиакриламидном геле с додецил сульфатом натрия (ДДС-ПААГ).
3. Провести валидацию метода.
Материалы и методы
Определение белка проводится колориметрическим методом с бицинхониновой кислотой согласно ОФС «Определение белка» [12]. Допускается использование готовых наборов для определения белка «AppliChem BCA Protein Assay» (кат. № А 7787) или «Thermo scientific Pierce BCA Protein Assay Kit» (кат. № 000), или аналогичных в соответствии с инструкциями по применению. В качестве стандартного образца используется бычий сывороточный альбумин (БСА) («Sigma-Aldrich», кат. № А 3803) или аналогичного качества. Для построения калибровочной кривой готовится ряд разведений БСА с помощью стандартного буферного раствора с консервантом (СБР) с содержанием белка 500; 250; 125; 62,5; 31,25 мкг/мл. Раствором сравнения служит СБР.
Анализируемые пробы белка разводятся в 2 раза с помощью СБР. Далее к 1,0 мл испытуемого раствора добавляется 0,1 мл 0,15% раствора дезоксихолата натрия (ДХН). Раствор перемешивается на вихревой мешалке и выдерживается при комнатной температуре в течение 10 мин. Далее в пробы добавляется 0,1 мл 72% раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ), содержимое перемешивается на вихревой мешалке и выдерживается при комнатной температуре в течение 15 мин. Затем пробы прогреваются на водяной бане в течение 5 мин при 90 оС, после чего охлаждаются при (2-8) оС в течение 10 мин. Осадок отделяется центрифугированием при 10000 об/мин в течение 15 мин. Надосадочная жидкость осторожно удаляется, оставшийся осадок растворяется на вихревой мешалке путем добавления 1 мл 0,1 М раствора натрия гидроксида. Стандартные растворы БСА готовятся аналогично испытуемым образцам.
В лунки А1, А2, А3 планшета («Costar», кат. № 000, или аналогичный) вносится по 25 мкл стандартного образца в концентрации 500 мкг/мл; в лунки В1, В2, В3 - по 25 мкл стандартного образца в концентрации 250 мкг/мл; в лунки С1, С2, С3 - по 25 мкл стандартного образца в концентрации 125 мкг/мл; в лунки D1, D2, D3 - по 25 мкл стандартного образца в концентрации 62,5 мкг/мл; в лунки Е1, Е2, Е3 - по 25 мкл стандартного образца в концентрации 31,25 мкг/мл. В лунки F1, F2, F3 вносится по 25 мкл СБР (контроль). В лунки А4, А5, А6 вносится по 25 мкл испытуемого образца (в трех повторностях). Затем в каждую лунку добавляется по 200 мкл реактива С, содержимое лунок перемешивается многоканальной пипеткой и инкубируется в термостате при температуре 37 оС в течение 30 мин. По истечение времени планшет необходимо охладить при комнатной температуре около 5 мин, и провести измерение оптической плотности на фотометре «Multiskan Ascent» или аналогичном, при длине волны 540 нм.
Для учета результатов строится калибровочный график с использованием программного обеспечения Excel или вручную. По оси ординат откладывается оптическая плотность, а по оси абсцисс – соответствующая концентрация белка в мкг/мл. Содержание белка в испытуемых пробах определяется по калибровочному графику.
Электрофорез проводится в невосстановленных условиях в ПААГ согласно Laemmli U. K. [13].
Примечание: Состав СБР с консервантом: 9 г натрия хлорида (Р N002499/01-171108, Р N001077/01-180308, ЛСР-007720/ 09-011009), 28 г глицина (Ph. Eur., USP), 1,5 г натрия гидрофосфата (ГОСТ 4172-76, Ph. Eur.), 0,12-0,14 г калия дигидро-фосфата (ГОСТ 4198-75), 10 мл тиомерсала (Ph. Eur., USP) раствора 1%, вода для инъекций (ФС 42-2620-97) до 1 л.
Результаты и обсуждение
В соответствии с ОФС «Определение белка» [12] и требованиями ЕФ [14] для устранения влияния мешающих соединений предлагаются два метода - разведение и осаждение белка. Для этой цели используется «Метод В» [12] с предварительным осаждением белка или практически аналогичный «Метод 2» ЕФ [14]. Согласно преамбуле ОФС «Определение белка»: «Для таких лекарственных средств могут использоваться модифицированные методики определения белка, указанные в фармакопейных статьях, в которых могут быть изменены рекомендуемые области концентраций белка и/или объемы испытуемого раствора и реактивов и некоторые другие условия в соответствии с индивидуальными свойствами определяемого компонента» [12]. Для исключения влияния мешающих соединений при определении белка в гриппозных вакцинах содержащих желатин используется подобная пробоподготовка, включающая преципитацию белка с помощью ТХУ [15]. Для оптимизации этого этапа, согласно широко используемому «Протоколу определения белка» [10], необходимо индивидуально подбирать концентрацию преципитанта, рН и температуру. Центрифугирование рекомендуется проводить при более высокой скорости - 15000 g в течение 10 минут [16], в отличие от 3000 g по утвержденной отечественной ОФС «Определение белка» [12]. Следовательно, с учетом конкретного белка и присутствующего матрикса, как правило, мешающего, подбираются специальные условия пробоподготовки.
Влияние интерферирующих субстанций на определение белка может быть исключено или минимизировано путем предварительного разведения анализируемых образцов и/или преципитации белка. В связи с присутствием вспомогательных веществ в составе вакцины «Микросплит», создающих систематическую ошибку, а также необходимостью приведения проекта ФСП на вакцину «Микросплит» в соответствии с ОФС «Определение белка» [12] нами был доработан метод определения белка, позволяющий нивелировать влияние глицина за счет использования дополнительного «Метода В» в нашей модификации, заключающегося в предварительном разведении пробы и температурном инкубировании с ДХН и ТХУ в концентрациях и соотношениях, указанных в ОФС «Определение белка» [12].
На первом этапе, на модельном белке БСА в аналогичном матриксе (в присутствии мешающих соединений) нами было определено необходимое разведение пробы (без разведения, 1:1, 1:2, 1:4, 1:8), максимально снимающее ингибирование присутствующих соединений. Начиная с двукратного разведения, произошло увеличение концентрации общего белка в 1,66-1,76 раза, причем для всех следующих друг за другом двукратных разведений были получены единые результаты. Следовательно, получение заниженных результатов для неразведенных образцов объясняется ингибированием реакции определения белка из-за наличия мешающих соединений, поэтому необходимо как минимум двукратное разведение проб.
Проведение двух подготовительных стадий: разведения и преципитации белка (для снятия эффекта ингибирования) в модельном опыте с БСА в выбранных концентрациях (100, 200, 400 мкг/мл) в присутствии мешающих соединений, однако, показало занижение истинных результатов примерно в 2 раза при сравнении с калибровочной кривой с БСА в отсутствии мешающих соединений и без проведения стадии осаждения, что привело к необходимости изучить влияние дополнительного температурного фактора для увеличения эффективности преципитации белка. Согласно японским нормативным требованиям для увеличения эффективности преципитации белка используется кипячение в течение 15 минут [17]. Для полного осаждения белка нами были подобраны оптимальные условия температурной обработки проб перед центрифугированием. Идеальным оказалось сочетание инкубирования образцов с ДХН и ТХУ при 90 оC в течение 5 минут. Увеличение температуры и/или времени прогрева приводило к появлению мутности (вероятно из-за денатурации белка) в уже растворенном преципитате и, как следствие, к завышению результатов, а уменьшение температуры и времени обработки – к занижению результатов. Дальнейшее колориметрирование осажденного центрифугированием белка осуществлялось согласно методу, указанному в проекте ФСП «Микросплит».
В таблице 3 приведены данные содержания белка, полученные при разных условиях пробоподготовки, учитывающие добавленное количество ЧСА и подтверждающие необходимость температурного инкубирования проб при 90 оС в течение 5 мин и центрифугирования при 10 000 об/мин 15 мин.
Как видно из представленных данных содержание белка без учета (ЧСА) в экспериментально-производственных сериях 1, 2, 3 вакцины «Микросплит» составляет 97,7±2,26 мкг/0,5 мл, что фактически полностью соответствует его содержанию в зарубежных сплит вакцинах Influsplit/Fluarix (99 мкг/0,5 мл) и Vaxigrip (93 мкг/0,5 мл) [18], что еще раз подтверждает правильность выбранного способа пробоподготовки. Общее содержание белка с учетом ЧСА в разрабатываемой вакцине «Микросплит» составляет 345,3±4,51 мкг/мл (M±SD, n=3), что соответствует критериям ЕФ для сплит вакцин – содержание белка должно быть не более 600 мкг/мл. Представляется интересным, что в зарубежных субъединичных вакцинах Influvac, Agrippal, Fluvirin содержание белка примерно в 2,1 раза ниже, чем в сплит вакцинах Vaxigrip, Begrivac, и Influsplit/Fluarix, однако это, по заявлению Chaloupka I. et al. [18], не является свидетельством повышенной степени очистки субъединичных вакцин. Более высокое содержание белка в расщепленных вакцинах объясняется присутствием эндогенных вирусных белков, таких как матриксные и нуклеопротеины, основная роль которых заключается в развитии клеточно-опосредованного иммунитета, слабо или вообще не регистрируемого в субъединичных вакцинах. Эти дополнительные антигены принадлежат к антигенам, на которые направлена активность цитотоксических Т-лимфоцитов.
Таблица 3 – Содержание белка в экспериментальных сериях вакцины «Микросплит» при разных условиях пробоподготовки и способах расчета результатов
№ п/п | Отличительные условия пробоподготовки1 | Содержание белка, мкг/мл | ||||
Температурная обработка | Центрифугирование | Серия 1 | Серия 2 | Серия 3 | (M±SD), n=3 | |
1 | нет | 3000 об/мин, 30 мин | 140 | 153 | 152 | 148,3±5,91 |
2 | 90 оC, 5 мин | 10000 об/мин, 15 мин | 341 | 350 | 345 | 345,3±4,51 |
22 | 191 | 200 | 195 | 195,3±4,51 | ||
23 | 95,5 | 100,0 | 97,5 | 97,7±2,26 |
Примечание: 1. Общие условия пробоподготовки - разведение (1:1), осаждение ДХН/ТХУ.
2. Содержание белка без учета ЧСА (150 мкг/мл).
3. Содержание белка без учета ЧСА (75 мкг/0,5 мл) в дозе вакцины «Микросплит».
Для подтверждения правильности определения белка, согласно рекомендациям фирмы BIO-RAD [19, 20], нами был выбран дополнительный независимый метод определения общего белка - электрофорез в ДДС-ПААГ, который удаляет все мешающие соединения, присутствующие в гриппозной вакцине. Однако данный метод является более длительным (3-4 ч) и трудоемким для рутинного использования, так как требует не только специальной пробоподготовки, но и отдельного приготовления геля, растворов, а также использования специализированого оборудования и специального программного обеспечения. По данным электрофореза в ДДС-ПААГ в сериях 1, 2 и 3 вакцины «Микросплит» содержание ЧСА составило 43,4; 44,7 и 43,1 % соответственно. Следовательно, с учетом известного количества ЧСА (150 мкг/мл), добавленного в каждую серию вакцины, общее содержание белка в сериях 1, 2 и 3 по данным электрофореза составит 345,6, 335,6 и 348,0 мкг/мл, соответственно. В то же время по данным БХМ содержание белка в серии 1 показало 341 мкг/мл, в серии 2 - 350 мкг/мл, в серии 3 – 345 мкг/мл, поэтому, процентное отклонение результатов, полученных БХМ от данных электрофореза ДДС-ПААГ составило для серии 1 – 1,3 %, для серии 2 – 4,1 %, для серии 3 – 0,8 %. Таким образом, сравнение двух методов определения белка (БХМ и электрофореза ДДС-ПААГ) подтвердило пригодность БХМ для определения содержания белка в вакцине «Микросплит».
Валидация разработанного модифицированного БХМ подтвердила необходимые валидационные характеристики – специфичность (давать значимый аналитический сигнал в образцах содержащих белок и не давать значимый аналитический сигнал в образцах, не содержащих белок, но имеющих тот же состав по остальным компонентам); линейность (коэффициент корреляции должен быть не менее 0,990) – 0,9993 (по пяти точкам); повторяемость/сходимость (коэффициент вариации не более 3 %) – 2,55-2,98 % (n=6), внутрилабораторная воспроизводимость (коэффициент вариации не более 5 %) – 2,55-2,86 % (n=3); правильность (процент восстановления должен быть от 90 % до 110 %) – 99,4-109,8 % (n=5); диапазон применения – 31,25-500 мкг/мл (коэффициенты вариации определений в точках диапазона от 1,67 % до 4,26 %).
Выводы
1. Изучена возможность нивелирования влияния мешающих соединений при определении белка бицинхониновым методов в гриппозной вакцине «Микросплит». Наилучший результат показала пробоподготовка, включающая предварительное двукратное разведение пробы, обработку ДХН/ТХУ, температурное инкубирование при 90 оС в течение 5 мин, центрифугирование при 10 000 об/мин 15 мин, растворение осадка 0,1 М раствором натрия гидроксида.
2. Проведено сравнение модифицированного бицинхонинового метода определения белка с альтернативным методом – электрофорезом в ДДС-ПААГ. Процентное отклонение результатов содержания белка, полученных БХМ от данных электрофореза ДДС-ПААГ составило от 0,8 до 4,1 %, что подтверждает пригодность БХМ для определения содержания белка в вакцине «Микросплит».
3. Проведена валидация модифицированного бицинхонинового метода определения общего белка по параметрам: специфичность, мера прецизионности (оценка повторяемости/сходимости и внутрилабораторной воспроизводимости), линейность, правильность, диапазон применения. Результаты валидации подтверждают, что данный метод дает воспроизводимые, достоверные результаты, соответствующие критериям оценки.
Предложенные принципы и подходы к определению общего белка могут быть рекомендованы к использованию для любых методов определения белка, а также для любых белковых препаратов.
Список литературы
Monograph № 000. Influenza vaccine (split virion, inactivated). EUROPEAN PHARMACOPOEIA. WHO Expert Committee on Biological Standardization. Fifty-eighth report. Annex 2. Regulatory preparedness for human pandemic influenza vaccines. WHO technical report series, no. 963, pp. 117-224. A.3.5.3 Total protein. Recommendations for production and control of influenza vaccine (inactivated). Adopted by the 54th meeting of the WHO Expert Committee on Biological Standardization, 17-21 November 2003. WHO Technical Report Series. pp. 19-20. Sadowski T., Li J., Boddapati S., Pincus S. Release and stability testing programs for a novel virus-like particle vaccine. BioPharm International, оct 2010 Supplement, рp. 26-34. Tang X-C, Lu H-R, Ross T. M. Baculovirus-produced influenza virus-like particles in mammalian cells protect mice from lethal influenza challenge. Viral Immunol, 2011, no. 24, pp. 311-319. Kommareddy S., Bonificio A., Gallorini S., Baudner B., Singh M., O'Hagan D. Preparation of highly concentrated influenza vaccine for use in novel delivery approaches. J Pharm Sci., 2013 Mar, no. 102(3), pp. 866-875. Jing X., Soto J., Gao Y., Phy K., Ye Z. Assessment of viral replication in eggs and HA protein yield of prepandemic H5N1 candidate vaccine viruses. Vaccine, 2013 Aug 28, no. 31(38), pp. 4091-4097. Thompson C. M., Petiot E., Lennaertz A., Henry O. and Kamen A. A. Analytical technologies for influenza virus-like particle candidate vaccines: challenges and emerging approaches. Virology Journal, 2013, no. 10, 141 p. Krieger N., Ramos L. P., Fontana J. D. 2. Methods for protein determination. Biotechnology, vol. - II Chemical methods applied to biotechnology. Encyclopedia of life support systems (EOLSS). Current Protocols in Protein Science. Assays for Total Protein. pplement 1, 22 p. URL: http://www. ibt. lt/uploads/file/bvtl-2/assays_3.pdf (Accessed 17 May 2016). Protein assay. Technical handbook. Pierce. 1601325, 12/05, pp. 1-40. ОФС «Определение белка». Приказ № 000 МЗ РФ от 01.01.2001. Laemmli U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 1970, no. 227, pp. 689-685. 2.5.33. Total protein. EUROPEAN PHARMACOPOEIA 7.0, pp. 147-150. Peterson R. C. Application of lowry protein determination to influenza vaccine. Journal of Pharmaceutical Sciences, 1969, vol. 58, Issue 1, pp. 141–142). URL: http://www. biochem. uwo. ca/wits/bmsl/protocols. html (Accessed 17 May 2016). Test for protein content. Minimum requirements for biological products. National institute of infectious diseases Japan, 2006, 292 p. Chaloupka I., A. Schuler, M. Marschall, H. parative analysis of six european influenza vaccines. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., 1996, no. 15, pp. 121-127. Zhu K. and Strong W. Protein Quantitation: a comparative analysis using the experion automated electrophoresis system, Bradford and modified Lowry assays, and SDS-PAGE. Bio-Rad bulletin tech note 5423, 2006, pp. 1-6. Wu F. F, Strong parison of protein quantitation methods using the experion automated electrophoresis system. Bio-Rad bulletin technical report 5784, 2007, pp. 1-4.