"Инструкция по организации и технологии работы станций и предприятий по искусственному осеменению сельскохозяйственных животных" (утв. Минсельхозом СССР 20.06.1979) (стр. 18 )

│  Компоненты  │  Норма  │

├───────────────────────────────────────────────────────────┼─────────────┤

│Лактоза, г  │11,0  │

│Натрий двууглекислый, мг  │8,0  │

│Натрий лимоннокислый, трехзамещенный, пятиводный, мг  │89,0  │

│Двунатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты  │100,0  │

│(трилон Б, хелатон-3), мг  │  │

│Желток куриных яиц, мл  │1,6  │

│Глицерин, мл  │3,5  │

│Спермосан-3, тыс. ед.  │25 - 30  │

│Вода дистиллированная  │100,0  │

└───────────────────────────────────────────────────────────┴─────────────┘

9.9. Техника приготовления синтетических сред.

9.9.1. Для разбавления спермы применяют синтетические среды, выпускаемые в виде сухих заготовок или приготовленные из отдельных компонентов непосредственно перед применением. Компоненты, предназначенные для разбавления спермы, должны быть химически чистыми и храниться в герметической упаковке в сухом темном помещении при температуре не ниже 5 °C.

9.9.2. Синтетические среды готовят в день разбавления спермы. Приготовленные среды должны быть стерильными.

Сухие заготовки ГЦЖ, лактозы, ЛФРМГЖ, ГХЦС, выпускаемые медицинской промышленностью, готовят согласно наставлению по их применению.

Компоненты, входящие в состав сред, взвешивают на аналитических или технохимических весах. Перед взвешиванием реактивов проверяют точность весов, затем тампоном, смоченным 96-градусным спиртом, протирают правую чашку весов.

В стерильную химическую колбу наливают необходимый объем прокипяченной дистиллированной воды (отмеривают мерным цилиндром) и добавляют все компоненты, за исключением санирующих препаратов, глицерина и желтка.

Приготовленную среду стерилизуют в водяной бане 5 - 10 мин. с момента закипания воды в бане, затем охлаждают до 35 - 40 °C и добавляют спермосан, глицерин, желток. Колбу со спермой накрывают стерильной пергаментной бумагой и фиксируют резиновым кольцом.

9.9.3. Яйца перед использованием моют, протирают спиртовым (96°) тампоном, раскалывают пополам, сливают белок в банку, а желток осторожно перекладывают на стерильный лист фильтровальной бумаги, прокалывают его оболочку и сливают в измерительную мензурку.

Подготовленный желток вносят в колбу с синтетической средой. После тщательного перемешивания среда может быть использована для разбавления спермы.

Температура среды перед разбавлением должна быть одинаковой со спермой.

9.9.4. Среда должна быть использована в течение 3 - 4 ч с момента ее приготовления. Во время разбавления спермы среду следует держать в водяной бане или термостате с целью поддержания необходимой температуры.

9.9.5. Биологический контроль сред. Качество синтетической среды определяют биологическим путем - по длительности выживаемости спермиев при различных разбавлениях спермы, сохраняемой при температуре 2 - 5 °C. Необходимо проводить биоконтроль каждой вновь поступившей серии антибиотиков, сульфаниламидов, глюкозы, цитрата и других компонентов, входящих в состав синтетической среды. Биоконтроль позволяет установить оптимальные и токсичные степени разбавления спермы. Оптимальную степень разбавления спермы определяют по наибольшему показателю абсолютной выживаемости спермиев.

9.10. Техника разбавления спермы производителей синтетическими средами.

9.10.1. Если после предварительной оценки сперма производителя признана годной, ее непосредственно в спермоприемнике разбавляют 1:1 или 1:2 и после 5 - 10-минутной выдержки переливают в градуированный смеситель емкостью 100 - 200 мл, измеряют объем. Разбавитель температурой 25 - 30 °C небольшими порциями вводят по стенке в смеситель или колбу со спермой и смешивают после добавления каждой порции.

9.10.2. В зависимости от подвижности и концентрации спермиев сперму быка разбавляют в 20 - 50 и более раз с таким расчетом, чтобы в одной дозе разбавленной спермы для всех способов хранения перед осеменением было не менее 10 млн. спермиев с ППД 3 балла (30%).

Сперму барана разбавляют в 2 (1:1) - 4 (1:3) раза с концентрацией в дозе не менее 80 млн. спермиев.

Сперму хряка разбавляют в 2 (1:1) - 10 (1:9) раз с концентрацией в дозе не менее 3 млрд. спермиев через 30 - 60 мин. после взятия и определения ее качества.

Сперму жеребца разбавляют в 4 (1:3) раза с концентрацией в дозе не менее 3 млрд. спермиев.

9.10.3. Разбавление спермы быков ЛФРМГЖ-средой для замораживания в полипропиленовых соломинках.

Сухие заготовки среды вносят в стерильную колбу, добавляют необходимый объем прокипяченной дистиллированной воды 70 - 80 °C, растворяют, охлаждают до 30 - 32 °C и вносят спермосан, глицерин и желток.

При отсутствии сухих заготовок среды компоненты стерилизуют ультрафиолетовыми лучами в бактерицидной камере в течение 15 - 20 мин., отвешивают на аналитических весах и готовят среду, как указано выше.

Температуру среды перед разбавлением спермы (31 +/- 1 °C) поддерживают в бактерицидной камере, термостате или в специальной водяной бане.

Сперму разбавляют в зависимости от подвижности и концентрации спермиев в эякуляте (Приложение 18 - табл. 1).

Разбавляют сперму быков при температуре 31 +/- 1 °C в мензурке.

Для постепенного охлаждения разбавленную сперму помещают в стеклянный стакан с водой температурой 31 +/- 1 °C и переносят в водяную баню с температурой воды 22 °C на 20 мин.

Дальнейшая технологическая обработка спермы (расфасовка, закупорка и раскладка в штативы) проводится при комнатной температуре.

Расфасованную сперму помещают в холодильник при температуре 4 °C и выдерживают 3 - 4 ч.

9.10.4. Разбавление спермы быков синтетическими средами для замораживания в облицованных гранулах.

В качестве разбавителя используют среды N 1 и 2. Процесс разбавления спермы осуществляют по таблице 2 (Приложение 18) с помощью устройства (рис. 12), позволяющего дозированно вводить среды в спермоприемник по закрытой системе без соприкосновения с окружающей средой.

Устройство состоит из эластичной полиэтиленовой емкости для разбавителя, соединенной эластичной трубкой с патрубками цилиндра-дозатора. Верхний конец дозатора герметически закрыт соразмерным его объему эластичным колпаком из полиэтиленовой пленки. Соединительная трубка по обе стороны от дозатора пережимается пружинными зажимами (рис. 13).

Емкость для разбавителя представляет собой пакет из полиэтиленовой пленки толщиной 120 - 150 микрон, к которому герметически подсоединен отрезок полиэтиленовой трубки диаметром 4 - 6 мм и длиной 20 - 25 мм. В качестве емкости может быть использован описанный выше одноразовый спермоприемник.

Дозатор изготовляют из мерного цилиндра, в нижнюю часть которого вваривают два небольших стеклянных патрубка для соединения с трубками.

В качестве колпака используется пакет из полиэтиленовой пленки, который фиксируют резиновым кольцом на открытой цилиндрической части дозатора.

Перед работой емкость для разбавления стерилизуют ультрафиолетовым облучением, а дозатор с колпаком и соединительными трубками - путем автоклавирования при 0,5 атм. в течение 30 мин. При этом свободные концы трубок закрывают чехлами из пергаментной бумаги.

Для разбавления спермы используют два устройства, которые заполняют средами N 1 и 2. Устройство со средой N 1 размещают в термостате при температуре 35 °C, устройство со средой N 2 используют в условиях комнатной температуры (18 - 22 °C).

Непосредственно после взятия сперму разбавляют средой N 1 в соотношении 1:1 и выдерживают при комнатной температуре (18 - 22 °C) в течение 5 - 10 мин., до окончания оценки эякулята. Затем дополнительно ее разбавляют средой N 2, имеющей комнатную температуру, до требуемой концентрации спермиев в дозе.

9.10.5. Разбавление спермы быков синтетической средой для замораживания в форме гранул на фторопластовых пластинах, охлажденных жидким азотом, или блоках твердой двуокиси углерода. Для разбавления применяют лактозо-желточную среду с глицерином. Разбавленную сперму охлаждают при 2 - 5 °C в течение 3 - 4 ч. После эквилибрации проверяют на подвижность спермиев, допуская к замораживанию сперму быков с оценкой не ниже 8 баллов, затем расфасовывают по 0,1 - 0,2 мл на охлажденную пластинку из полимерного материала (фторопласт), см. п. 10.5.

9.10.6. Разбавление спермы жеребцов ЛХЦЖ-средой для замораживания в форме гранул или пластин. Сперму жеребцов разбавляют синтетической ЛХЦЖ-средой в соотношении 1:3, с подвижностью спермиев не ниже 6 баллов и концентрацией 150 млн./мл.

Разбавленную сперму объемом не более 100 мл при высоте слоя 2,5 см в колбе выдерживают в холодильнике 2 ч и замораживают на поверхности сухого льда или в алюминиевых пакетах в парах жидкого азота в соответствии с пунктом 10.6.

10. ХРАНЕНИЕ, ТРАНСПОРТИРОВКА И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ

СПЕРМЫ ПРОИЗВОДИТЕЛЕЙ

10.1. В зависимости от технического оснащения станций и пунктов искусственного осеменения сельскохозяйственных животных в настоящее время применяют кратковременное хранение спермы быков, баранов, хряков и жеребцов-производителей при температуре, близкой к 0 °C (2 - 5 °C) или при температуре 16 - 20 °C.

10.1.1. При кратковременном хранении сперму сохраняют: быков до 72 ч, баранов до 24 ч при 2 - 5 °C и транспортируют в широкогорлых пищевых термосах.