Н. п. Максимова Молекулярная генетика Сборник заданий и тестов (стр. 5 )

Для изучения молекулярной организации этого гена было получено четыре различных мутации:

Мутация 1 вызвала делецию участка от 0,8 до 1,0 т. п. н., в резуль­тате чего был частично инактивирован промотор, что привело к 5- крагному снижению скорости транскрипции. Скорость трансляции мРНК гена Q осталась прежней.

Мутация 2 - точковая нонсенс-мутация, затрагивающая нуклеотид 2, 5 т. п. н.

Мутация 3 — точковая миссенс-мутация, затрагивающая нуклеотид 2,6 т. п. н. Эта мутация устранила сайт разрезания ДНК ферментом Eco R.

Мутация 4 вызвала делецию участка от 2, 0 до 2, 5 т. п. н.

Затем каждая из мутаций изучалась тремя различными методами:

Саузерн-блот-гибридизацией. Для этого геномную ДНК каждого мутанта обрабатывали рестриктазой Eco RI, проводили электрофорети­ческое разделение и денатурацию фрагментов, переносили на нитроцел­люлозный фильтр и гибридизовали с меченой пробой ДНК размером 4,8 т. п. н. Ват Н1 фрагмента гена Q: Норзен-блот-гибридизацисй. Для этого РНК из клеток каждого мутанта подвергали электрофоретическому разделению, переносили на нитроцеллюлозный фильтр и обрабатывали меченой пробой ДНК разме­ром 4,8 т. п. н. Ват Н1 фрагмента гена (?; Вестерн-блот-гибридизацией. Для этого белки из клеток каждого мутантного штамма подвергали электрофоретическому разделению и обрабатывали меченой пробой анти-<2-антител.

Задача. Изобразите графически результаты гибридизации с приме­нением трех методов для штамма дикого типа и для каждого мутан га от­дельно. Для образца используйте рис. 15 (см. стр. 27).

Задание 2. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ГЕНОВ,
КОНТРОЛИРУЮЩИХ СИНТЕЗ ПИГМЕНТА
У РАСТЕНИЙ

Для идентификации генов, связанных с синтезом пигмента у рас­тений, был использован метод Саузерн-блот-гибридизации. Исполь­зовали растения генотипа ЕВ, у которых цветки окрашены в красный цвет, генотипа Ег с цветками, окрашенными в розовый цвет и геноти­па гг с белыми цветками. Рестрикционная карта гена И представ­лена на рис. 14.

начало        экзон 1        ткзон 2

транскрипции	1 ...	интрон
1        1—	-Ь - тг	1	Ј -1 1
1 0.2 1	1.0	0,1 1	|о,3| 10,4 0,66 0,56

ЕН        ЕЕ Н Н ЕЕ

Е - EcoR 7; Н - Hind III Рис. 14. Рестрикционная карта i сна R

На первом этапе работы выделяли геномную ДНК из всех трех ва­риантов растений (RR, Rr и гг), затем каждую пробу обрабатывали рест - риктазами: Eco R1 (вариант 1), Hind III (вариант 2) и Eco Rl + Hind III (вариант 3). Полученные образцы подвергали электрофоретическому разделению и затем переносили на нитроцеллюлозный фильтр по из­вестной методике. В качестве пробы для выявления искомых фрагмен­тов ДНК использовали меченную к ДНК R гена. Результаты радиоауто - графического анализа представлены на рис. 15.

Задача. Предположим, что при постановке эксперимента был по­очередно исключен каждый из перечисленных ниже этапов:

Обработка ДНК растений рсстриктазами.

Б. Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК.

Денатурация ДНК щелочью.

Г. Капиллярный перенос фрагментов ДНК.

Д. Стабилизация фрагментов ДНК на нитроцеллюлозном фильтре. Е. Добавление ДНК-пробы.

Ж. Промывание нитроцеллюлозного фильгра водой на заключи­тельном этапе.

Определите, как изменился бы вид радиоаутограмм в трех вариан­тах опыта (растений Ю1-, Кг - и гг-генотипа) при постановке эксперимен­тов с модификациями от А до Ж.

Раздел 3. РЕПЛИКАЦИЯ ДНК И ЕЕ МЕХАНИЗМ

Вопросы и задачи

Культуру бактерий Е. coli выращивали в течение длительного времени на среде, содержащей азот I5N. Затем клетки перенесли на среду с 14N, где нарас'1 или их в течение одной генерации. А. Как распределится азот 15N и 14N в ДНК, если учесть, что ре­пликация происходит:

а)        по консервативному типу;

б)        по полуконсервативному типу;

в)        дисперсно.

Как распределится метка после выращивания бактерий на сре­де с легким азотом l4N после двух генераций при предположе­нии, что репликация происходит по:

а)        консервативному типу;

б)        полуконсервативному типу;

в)        дисперсно.

Фермент ДНК-полимеразы I принимает участие в репликации ДНК. Имеет ли этот фермент иную активность, кроме ДНК-полиме - разной? Как работает этот фермент in vivo? Важна ли активность ДНК-полимеразы I для клеток Е. colil Почему? Как называется фермент, ответственный за синтез ДНК как при репликации, так и при репарации? У бактерий E. coli вновь синтезированная Д1К кратковременно обнаруживается в виде фрагментов длиной 1000 - 2 000 нуклеотидов. Какое они имеют название? Для запуска синтеза ДНК с участием ДНК-полимеразы III в отли­чие от синтеза РНК с помощью РНК-полимеразы совершенно необходи­мо определенное строение молекулы ДНК. Какое? Если ДНК-полимераза в процессе синтеза ДНК ошибочно при­соединит неправильный нуклеотид к З'-концу, ее отдельный каталитиче­ски активный домен удалит неподходящее основание. Как называется эта активность ДНК-полимеразы и в каком направлении она работает (3' —» 5', или наоборот)? Расплетение двойной спирали ДНК в зоне репликативной вилки катализируется ферментом, использующим для направленного движения по ДНК энергию гидролиза АТФ. Как называется этот фермент? Для бактерий и некоторых вирусов, инфицирующих эукариоти­ческие клетки, было показано, что репликационные глазки образуются в тех участках молекулы ДНК, где находятся специальные последователь­ности. Как они называются? Укажите, верно ли утверждение, что у Е. coli репликативная вил­ка продвигается вперед со скоростью 500 - 1000 пар нуклеотидов (п. н.) в секунду, а цепи ДНК перед вилкой вращаются с круговой скоростью почти 3000 об/мин. Укажите, верно ли утверждение, что при утрате ДНК-полимера - зой (3'—»5^ экзонуклеазной активности клетками Е. coli должна умень­шиться скорость синтеза ДНК, по не его точность. Укажите, верно ли утверждение, что в клетках дрожжей, мутант­ных по гопоизомеразе Н, ДНК может реплицироваться, но хромосомы не могут разделяться в процессе митоза.

ТЕСТЫ

•у

Самая большая хромосома D. melanogaster имеет 6,5 х 10 пар нуклеотидов (п. н.). Скорость репликации ДНК у дрозофилы 2 600 п. н. в минуту при 25 °С. В период активного роста дрозофилы ее хромосомы могут удваиваться практически через каждые 5—7 ч. Почему? Скорость репликации ДНК в клетках дрозофилы на самом деле гораздо выше и равна 2,1 х 105п. н. в секунду.

Б. В период активного роста у дрозофилы нарушен клеточный цикл. Репликация хромосом идет практически непрерывно.

Каждая молекула ДНК в хромосоме дрозофилы имеет более 2000 точек ог/^ш-репликации.

Г. С такой скоростью образуются только политепные хромосомы.

Д. Хромосомы в активно делящихся клетках дрозофилы реплици­руются через 10-12 дней.

Культуру бактерий Е. coli вырастили в течение длительного времени на среде, содержащей азот l5N. Затем клетки перенесли на среду с I4N, где они находились в течение одной генерации. После этого клет­ки вновь поместили на среду с,5N, на время, соответствующее одной ге­нерации. Затем из бактерий выделили ДНК, подвергли центрифугирова­нию в градиенте плотности CsCl и проанализировали распределение ра­диоактивной метки (рис. 15). Какую картину можно увидеть при анализе полученного препарата?

А        Б        В        Г        ДЕ

г—1
15л/	15*	15*
14*15*	14*15*	14*15*	14*15*
14*	15*
ч_/	О1

Рис. 15. Распределение радиоактивной метки после центрифугирования проб ДНК в градиенте CsCl

Систему синтеза ДНК in vitro использовали для изучения репли­кации вирусного генома, представленного двухнитчатой кольцевой мо­лекулой ДНК. Локализация сайтов рестрикции МЪо1 представлена на рис. 16.

Mbol

Рис. 16. Рестрикционная карта кольцевого генома вируса

Репликацию осуществляли, используя в качестве матрицы вирус­ную ДНК, экстракты инфицированных клеток в качестве источника ферментов, а также нуклеотидтрифосфаты (дГТФ, дЦТФ, дАТФ, дТТФ и АТФ), меченные ЛР. После этого продукты реакции, обработанные ре - стриктазой МЬо1, подвергли электрофоретическому разделению и визуа­лизировали с помощью радиоаутографии (рис. 17, колонка 1). Анало­гичная реакция проводилась в присутствии насыщающей концентрации немеченого 2',3-дидезоксиГТФ (ддГТФ) (рис. 17, колонки 2-4).

Рис. 17. Электрофореграмма МЈ»о/-фрагментов, полученных после репликации вирусного генома в присутствии меченых дезоксирибонуклеотидов (колонка 1), а также при насыщающей концентрации немеченого ддГТФ (колонки 2-4)

Судя по результатам рис. 17, точка оп#ш-решшкации находится на фрагменте:

А. А        В. С        Д. Е

Б. В        Г. Б

Пользуясь информацией вопроса 14, определите, каков меха­низм репликации вирусного генома.

I        И

Двунаправленная репликация.        А. Консервативная.

Б. Однонаправленная репликация.        Б. Полуконсервативная.