Инструкция по применению тест-системы иммуноферментной для определения индекса авидности антител класса G к вирусу простого герпеса "ВПГ-IgG-авидность"

ИНСТРУКЦИЯ ПО ПРИМЕНЕНИЮ  ТЕСТ-СИСТЕМЫ  ИММУНОФЕРМЕНТНОЙ  ДЛЯ  ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИНДЕКСА АВИДНОСТИ АНТИТЕЛ  КЛАССА G  К  ВИРУСУ ПРОСТОГО ГЕРПЕСА

"ВПГ-IgG-авидность"

Тест-система "ВПГ-IgG-авидность"  представляет собой набор реагентов для опре­деления индекса авидности иммуногло­булинов класса G к вирусу простого герпеса в сыворотках крови методом иммуноферментного анализа с использованием денатурирующего раствора (ДР).

Набор состоит из 14 реагентов: иммуносорбент –антиген ВПГ, сорбированный в лунках планшета; ВПК+ - высокоавидный положительный контрольный образец: инактивированная сыворотка крови человека, содержащая антитела класса G  к ВПГ, прозрачная бесцветная жидкость; НПК+ - низкоавидный положительный контрольный образец: инактивированная сыворотка крови человека, содержащая антитела класса G  к ВПГ, прозрачная жидкость красного цвета; К-  - отрицательный контрольный образец: инактивированная сыворотка крови человека, не содержащая антитела к ВПГ  – прозрачная, слегка опалесцирующая жидкость желтого цвета; РБР-К –разводящий буферный раствор для конъюгата, прозрачная жидкость зеленого цвета; конъюгат –антитела против иммуноглобулинов G человека с пероксидазой хрена, прозрачная жидкость зеленого цвета; РБР-С  - разводящий  буферный раствор для сывороток, прозрачная опалесцирующая жидкость синего цвета; РПР-С - раствор для предварительного разведения сывороток, прозрачная  жидкость светло-коричневого или коричневого цвета;  РС - раствор сравнения, прозрачная опалесцирующая жидкость жёлтого цвета; ДР - денатурирующий раствор, прозрачная опалесцирующая жидкость красного цвета; ФСБ-Т –  фосфатно-солевой буферный раствор с твином, прозрачная, слегка опалесцирующая, бесцветная жидкость; БРС – буферный раствор для субстрата, прозрачная бесцветная жидкость; ТМБ – хромоген, прозрачная бесцветная или светло-желтая жидкость;  стоп-реагент – прозрачная бесцветная жидкость.

Тест-система " ВПГ-IgG-авидность " рассчитана на 48 анализов, включая контрольные образцы.

Принцип метода

На первой стадии анализа исследуемые и контрольные образцы инкубируют в лунках параллельных рядов с иммобилизованным анти­геном ВПГ. Имеющиеся в сыворотке специ­фические антитела к ВПГ связываются с антигеном, формируя комплекс антиген-анти­тело. На второй стадии, после внесения белок-диссоциирующего агента в один из параллельных рядов, происходит диссоциация комплекса «антиген-антитело», включающий IgG с более низкими константами связывания (низкой авидностью). На третьей стадии связавшиеся антитела взаимодействуют с конъюгатом моно­клональных антител против IgG человека с пероксидазой хрена. Комплекс «антиген-анти­тело-конъюгат» выявляется реакцией с суб­стратом пероксидазы – перекисью водорода и хромогеном – тетраметилбензидином. После добавления раствора стоп-реагегнта измеряют оптическую плотность растворов в лунках при длине волны 450 нм. Интенсивность окрашива­ния пропорциональна количеству связанных в комплекс IgG к ВПГ.

Индекс авидности рассчитывается как отношение оптической плотности, полученной при выявлении в ИФА специфических IgG в денатурирующем растворе к оптической плотности, полученной при анализе без денатурирующего агента.

Для исследования небольших партий проб возможны 6 независимых постановок по 8 исследований каждая, включая контрольные образцы.

Набор комплектуется всеми необходимыми для ИФА реагентами.

Назначение

Тест-система предназначена для опреде­ления индекса авидности иммуноглобулинов класса G к ВПГ в сыворотке крови человека для  подтверждения диагноза острого ВПГ, уточнения сроков инфицирования и дифференцировки первичного ВПГ от хронической  и паст-инфекции.

Способ применения

Предупреждение! Несмотря на то, что тест-система "ВПГ-IgG-авидность " является полностью биологически безопасной, с ней следует обращаться, как с потенциально инфекционным материалом:

все использованные материалы подвергать обработке раствором спирта этилового с объемной долей 70 % или раствором водорода перекиси с массовой долей 6 % с последующей выдержкой при температуре от 20 до 25 °°С не менее 2 ч.

Внимание! При проведении анализа нельзя использовать компоненты из наборов разных серий или смешивать их в процессе приготовления растворов.

Окисляющие агенты, ионы металлов, моющие средства на посуде могут разлагать ТМБ. Во избежание ложных результатов необходимо тщательно отмывать посуду раствором кислоты серной 1 моль/л или кислоты соляной 1 моль/л с последующей отмывкой водой дистиллированной.

1 Приготовление реагентов и исследуемого материала

1.1 Приготовление ФСБ-Т

При наличии во флаконе с ФСБ-Т осадка солей флакон с концентратом выдержать при  температуре (37±±1) °°С до полного растворения солей.

Содержимое одного флакона с ФСБ-Т перенести в мерный цилиндр вместимостью 1 л и довести объем раствора до 650 мл водой дистиллированной.

Хранение: неиспользованный концентрат ФСБ-Т в течение срока годности набора при температуре

от 2 до 8 °°С, раствор ФСБ-Т – в течение месяца при температуре от 2 до 8 °°С.

1.2. Подготовка  РБР-С, ДР, РС,  РБР-К, РПР-С,

  РБР-С, ДР, РС, РБР-К, РПР-С,– готовы к использованию

Хранение: неиспользованные  РБР-С, ДР, РС,  РБР-К, РПР-С, хранят в течение срока годности набора при температуре от 2 до 8 °°С.

1.3.  Подготовка контрольных образцов.

К-,  ВПК+,  НПК+  - готовы к использованию.

Хранение: после вскрытия флакона до 48 ч при температуре от 20 до 25 °С и в течение срока годности набора при температуре от 2 до 8 °°С.

1.4. Приготовление рабочего разведения конъюгата.

Для приготовления рабочего разведения конъюгата в чистый флакон отобрать необходимое количество РБР-К в мл и добавить конъюгат в соответствии с таблицей 1. Раствор тщательно перемешать не допуская вспенивания.

Хранение: рабочий раствор конъюгата до 15 мин. при температуре от 20 до 25°°С., остаток концентрата при температуре от 2 до 8°°С в течение срока годности набора.

  1.5. Приготовление рабочего раствора ТМБ

При пониженной температуре возможна кристаллизация ТМБ во флаконе. В этом случае перед приготовлением рабочего раствора субстрата выдержать флакон с ТМБ  в течении 3-5 минут при температуре (37±1)°С до полного растворения ТМБ.

  Раствор  ТМБ готовить непосредственно перед использованием в защищенном от света месте.

  Для приготовления рабочего разведения ТМБ в чистый  флакон отобрать необходимое количество БРС в мл и добавить ТМБ в соответствии с таблицей 1. Раствор тщательно перемешать, не допуская вспенивания.

  Хранение: рабочий раствор субстрата  до 20 мин при температуре от 20 до 25 °С в защищенном от света месте, остаток ТМБ хранить в течении срока годности набора при температуре от 2 до 8°С.

1.6 Подготовка стоп-реагента

Стоп-реагент готов к использованию.

Хранение: не ограничено.

1.7. В случае использования одного или нескольких стрипов планшета в чистый флакон отобрать необходимое количество компонентов для данной серии в соответствии с таблицей. 

  Таблица 1  Серия 34

Количество используемых стрипов
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
Концентрат ФСБ-Т, мл	2	4	6	8	10	12	14	16	18	20	22	26
Вода дистил- лированная, мл	до 50	до 100	до 1500	до 200	до 250	до 300	до 350	до 400	до 450	до 500	до 550	до 650
РБР-К, мл	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
Конъюгат, мл	0,030	0,060	0,090	0,120	0,150	0,180	0,210	0,240	0,270	0,300	0,330	0,360
БРС, мл	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
ТМБ, мл	0,050	0,100	0,150	0,200	0,250	0,300	0,350	0,400	0,450	0,500	0,550	0,600

1.8.  Подготовка исследуемых сывороток

Для проведения анализа использовать образцы сыворотки или плазмы крови человека объемом не менее 50 мкл. Для исключения ложноположительных результатов исследуемые сыворотки необходимо готовить и хранить в стерильных условиях, исключающих возможность бактериального пророста. Необходимо осветлять образцы сывороток, содержащие осадок и агрегаты, путем центрифугирования. Не использовать сыворотки с выраженным гемолизом, гиперлипидемией и бактериемией. Избегать повторных циклов замораживания-оттаивания образцов. Не допускать тестирование пула, содержащего несколько образцов сывороток.

Каждый образец сыворотки или раствора необходимо отбирать новым наконечником. Для отбора исследуемых проб и компонентов применять автоматические пипетки с погрешностью измерения объема не более 2 %.

В лунку вспомогательного планшета внести 90 мкл РПР–С и  10 мкл исследуемой сыворотки (Разведение сыворотки в 10 раз). Раствор перемешать пять раз пипетированием, при этом цвет РПР-С должен измениться.

2. Проведение ИФА

Комплект перед проведением анализа выдержать в течение 30 мин при температуре от 20 до 25 °С.

2.1. Контрольные образцы сывороток внести попарно по 100 мкл в лунки стрипов для прямого и диссоциирующего ИФА.  (например, для прямого ИФА – в лунки стрипов А-1 внести К-; в лунку В1 внести ВПК+; в лунку С1внести НПК+. А для диссоциирующего ИФА – в лунки стрипов А2 внести К-; в лунку В2 внести ВПК+; в лунку С2 внести НПК+.)

В остальные лунки внести по 90 мкл РБР-С и по 10 мкл предварительно разведённых в 10 раз анализируемых сывороток  в дублях (для прямого и диссоци­ирующего ИФА). Раствор перемешать пять раз пипетированием, при этом цвет РБР-С должен измениться.

После этого планшет закрыть крышкой или заклеить клейкой лентой и инкубировать в течение 30 мин при температуре (37±1) °С.

2.2.  Планшет промыть три раза ФСБ-Т, при этом в каждую лунку планшета внести от 200 до 250 мкл раствора. По окончании промывки остатки жидкости удалить активным встряхиванием, постукивая планшетом по сложенной в несколько раз фильтровальной бумаге.

2.3. Во все лунки стрипов для прямого ИФА внести по 100 мкл раствора сравнения (РС). Во все лунки для диссоциирующего ИФА внести по 100 мкл ДР.  После этого планшет закрыть крышкой или заклеить клейкой лентой и инкубировать в течение 10 мин при температуре (37±1) °С.

2.4.  По окончании инкубации стрипы промыть два раза раствором ФСБ-Т как описано в п.2.2.

2.5.  После промывки и удаления влаги в каждую лунку планшета внести по 100 мкл раствора конъюгата в рабочем разведении (Таблица № 1).

Планшет закрыть крышкой или заклеить клейкой лентой и инкубировать в течение 30 мин при температуре (37±1) ° С.

2.6.  По окончании инкубации планшет промыть ФСБ-Т пять раз, как описано в п.2.2.

2.7.  Внести в каждую лунку планшета по 100 мкл  рабочего раствора ТМБ, приготовленного как описано в п.1.5.

Планшет  поместить на 15 мин в защищенное от света место  при температуре (37±1) ° С.

2.8.  Реакцию остановить внесением в каждую лунку планшета по 50 мкл стоп-реагента.

У ч е т  р е з у л ь т а т о в

Результаты ИФА регистрируют на  спектрофотометре. Оптическую плотность (ОП) измеряют  при длине волны 450 нм. Нулевой уровень («бланк») задают по воздуху. Результаты учитывают только в том случае, если значение ОП в прямом ИФА в лунке с контролем конъюгата (ОПКг) не превышает 0,15, в лунках с К-  ОП (ОПК-) не более 0,2,  в лунках с ВПК+  не менее 1.0 и НПК+  значение ОП  не менее 0,4.

Результаты теста считаются положительными, если ОП анализируемой сыворотки больше ОПкрит.

ОПкрит. рассчитывают по формуле

ОПкрит. = ОПК - + 0,2,

Индекс авидности (ИА) антител испытуемых сывороток рассчитывают (в %) по формуле:

ИА = ОП1 х 100/ОП2

где:
ОП1 — ОП в лунках с антигенами после обработки раствором, удаляющим низкоавидные IgG;
ОП2 — ОП в лунках с той же сывороткой, не обработанных раствором.

Качество тест-системы считать удовлетворительным, если:

– ОПср К– < 0,2 о. е.

– ИАср К+ВПК ≥ 50%

– ИАср К+НПК ≤  50%

3. Интерпретация результатов

Если индекс авидности исследуемой сыво­ротки менее 35%, то сыворотка содержит низко­авидные антитела, что указывает на пер­вичную инфекцию.

Если индекс авидности более 50%, то сыворотка содержит высокоавидные антитела, что указывает на паст-инфекцию.

“Серая” зона – индекс авидности IgG 36–49% указывает на позднюю стадию первичной инфекции.

Пример учета результатов

После измерения ОП могут быть получены следующие результаты:

ОПсрК– = 0,085 о. е.

Прямой ИФА	Диссоциирующий ИФА	Индекс авидности
ОПсрК+ВПК = 1,105 о. е.	ОПсрК+ВПК = 0,845 о. е.	ИАВПК= (0,845:1,105)х100% =76,4%
ОПсрК+НПК = 0,945 о. е.	ОПсрК+НПК = 0,315 о. е.	ИАНПК= (0,315:0,945)х100%= 33%
ОПсыв. = 0,650 о. е.	ОПсыв. = 0,230 о. е.	ИАсыв = (0,23:0,65)х100% =35%

4. Авидность антител. Применение в диагностике

По свойствам антител различают два понятия аффинность (или аффинитет) и авидность (или авидитет). Аффинность — это степень специфического сродства активного центра к антигенной детерминанте, авидность — это степень прочности связывания молекулы антитела с молекулой антигена. Чем выше аффинность (степень сpодства), тем выраженнее и авидитет (пpочность связывания). Кроме того, авидитет тем сильнее, чем больше связывающихся центров.

Термин аффинность относится к связыванию антитела с моновалентным гаптеном или с одной антигенной детерминантой. В большинстве случаев, однако, мы имеем дело со взаимодействием антисыворотки, т. е. сыворотки иммунизированного животного или человека. Для описания связывания АТ с поливалентным антигеном используют термин “авидность”. Авидность определяется многими сложными факторами, в частности, гетерогенностью антител в данной сыворотке, направленных к определенной антигенной детерминанте, а также гетерогенностью самих детерминант. Необходимо учитывать и следующее обстоятельство. Поливалентность большинства антигенов приводит к своеобразному “усиливающему” эффекту: огромное увеличение константы равновесия, возникающее из-за того, что составляющие аффинности не складываются, а перемножаются, и обеспечивает этот усиливающий эффект.

Таким образом, термин авидность используется для описания общего количества всех внутренних аффинностей обнаруженных в поликлональной антисыворотке.

Первичный иммунный ответ на ранее не встречаемые организмом антигены начинается с продукции IgM. IgG - это поздние антитела в филогенетическом и онтогенетическом отношении. При первичном иммунном ответе они сменяют ранние антитела IgM и накапливаются в организме в значительно больших количествах. IgG обладают наиболее высокими аффинностью и авидностью.

Анализ сыворотки крови пациента включает в себя определение антител, образующихся в организме в ответ на проникновение возбудителя. Об острой фазе заболевания говорит наличие вирусоспецифических антител IgM. Но срок их присутствия в организме варьирует от нескольких недель до месяцев и даже лет. Нарастание уровня IgG происходит в течение нескольких недель. При этом вначале образуются низкоафинные антитела, образующиеся в начале иммунного ответа при размножении вируса в организме и сохраняющиеся в течение 1-1,5 мес. от начала заболевания. Позже, в процессе созревания иммунного ответа, в организме появляются высокоафинные IgG антитела. Высокоафинные антитела остаются в организме длительное время. За счет этих антител развивается быстрый вторичный иммунный ответ в случае повторного попадания возбудителя в организм. В случае латентной инфекции в крови обнаруживаются IgM при обострении или реактивации инфекционного процесса.

В случаях, когда обнаруживаются IgM в крови, необходимо разделять первичную инфекцию и обострение, так как первичная инфекция у беременных женщин ведет к тяжелым последствиям для плода. Кроме того, различаются схемы лечения первичной и латентной инфекций. Для этого рекомендуется определять авидность антител IgG. Если в крови при наличии IgM обнаруживаются IgG с низкой авидностью, то это свидетельствует о первичной (недавней) инфекции. Наличие же высокоавидных антител IgG (в присутствии IgM) говорит о вторичном иммунном ответе в случае попадания возбудителя в организм или обострения (реактивации).

В ИФА тест-системах используют показатель индекса авидности антител (ИА). Суть метода заключается в следующем. При инкубации тестируемых сывороток с адсорбированными антигенами образуются иммунные комплексы. После промывания планшет в часть лунок добавляют раствор, который способствует удалению "ранних" IgG, отличающихся низкой авидностью. После внесения конъюгата контролируют его связывание с комплексом антиген-антитело с помощью раствора хромогена. Интенсивность окраски пропорциональна количеству антител к антигену в образце. После остановки ферментативной реакции измеряют оптическое поглощение окрашенного раствора с помощью спектрофотометра. Присутствие в исследуемом образце вирусспецифических антител с низкой авидностью определяется снижением интенсивности окрашивания по сравнению с лунками без раствора, удаляющего “ранние” IgG.

Выявление в испытуемой сыворотке антител с индексом авидности ниже 30-35% (у разных производителей) указывает на свежую первичную инфекцию обследованного пациента. Выявленный показатель авидности, равный или превышающий 40%, указывает на то, что в сыворотке содержатся анамнестические высоко-авидные антитела, свидетельствующие об инфекции в прошлом. Показатель авидности антител в интервале 31-39% может свидетельствовать о поздней стадии первичной инфекции или недавно перенесенной инфекции только при условии выявления антител в высокой концентрации.

Таким образом, определение авидности антител к данному возбудителю позволяет выделить первичную инфекцию, дифференцировать ее от периода реактивации или вторичного проникновения антигена в организм. Но данный тест рекомендуется применять для пациентов, в сыворотке крови которых обнаружены IgM.

5. Форма выпуска

Тест-систему "ВПГ-IgG-авидность"  выпускают в виде набора, упакованного в коробку из  картона, куда вкладывают инструкцию. 

Набор состоит из следующих компонентов: иммуносорбент, запаянный в пластиковый  пакет, – 1 шт.;  ВПК+ по 1,5 мл – 1 флакон;  НПК+ по 1,5 мл – 1 флакон;  К - по 1.5 мл - 1 флакон; РБР-К по 13 мл - 1 флакон; конъюгат по 0,45 мл - 1 флакон;  РБР-С по 10 мл - 1 флакон;  РПР-С по 13 мл - 1 флакон; РС  по 8 мл –1 флакон; ДР  по 8 мл –1 флакон;  ФСБ-Т по 26 мл - 1 флакон;  БРС -  по 13 мл – 1флакон; ТМБ – 0,7 мл 1 флакон; стоп-реагент по 6 мл - 1 флакон.

6. Срок годности, условия хранения и транспортирования

Срок годности набора 9 месяцев.

Хранение в соответствии с СП 3.3.2.1248-03 при температуре от 2 до 8 єС.

Транспортирование производить в соответствии с СП 3.3.2.1248-03 при температуре от 2 до 8 єС. Допускается транспортирование при температуре  до 25 єС в течение 10  суток.  На  дальние  расстояния  только  авиатранспортом.

Рекламации на качество наборов направлять на предприятие-изготовитель по адресу:
– спектр» (630559), Новосибирская обл., Новосибирский район, пгт. Кольцово, а/я 172,Тел/

7. общие рекомендации

–        При работе с исследуемыми сыворотками и контрольными образцами следует соблюдать меры предосторожности, принятые при работе с потенциально инфекционным материалом:

*                ра­бо­тать в резиновых перчатках;

*                не пипетировать рас­творы ртом;

*        все использованные материалы подвергать обра­ботке 6%‑ным раствором пере­киси водо­рода (не менее 6 ча­сов).

       Внимание!  Несоблюдение ­опи­сан­ных ниже требований может привести к искажен­ному результату ИФА.

–        Необходимо предъявлять высокие требования к чистоте лабораторной посуды, нако­неч­ников, ванночек и т. п., поскольку даже сле­ды применяемых дезинфицирующих и мою­щих средств приводят к искажению ре­зуль­татов ИФА.

–        Предпочтительно использование однора­зо­вой посуды.

- При работе с ТМБ и раствором конъюгата раствор необходимо отбирать  новыми наконечниками.

–        При многократном использовании контейнера или ванночки для компонента их следует использовать всегда для одного и того же реа­гента, при повторном применении следует тщательно промыть дистиллированной водой  до и после каждого использования.

–        Для работы с набором следует использовать

  дистил­лированную воду высокого качества, так как ком­по­ненты набора очень чувстви­тельны к микробиологическому загрязнению, хлорно­ватистой кислоте и ароматическим хлор­­­соединениям, ионам металлов, зачастую нахо­дящихся в воде.

–        При постановке ИФА нельзя использовать компоненты из наборов разных серий.

–        При использовании автоматического вошера или гребёнки ёмкость и шланги для промы­вочного раствора рекомендуется 1 раз в неделю обраба­тывать 70%-ным спиртом с после­дую­щей от­мывкой дистиллированной водой.

–        Перед постановкой реакции все компоненты тест-системы необходимо выдер­жать в течение часа при тем­пера­туре 18-25°С.

8. Возможные причины снижения чувствительности

–                Уменьшение времени инкубации (как прави­ло, субстратной реакции).

–                Использование загрязнённой посуды и нако­неч­ников.

–        Замачивание посуды и наконечников в пере­киси водорода или хлорсодержащих раство­рах без последующего кипячения в процессе мытья.

–        Плохая отмывка после инкубации сывороток.

–        Растворы, не нагретые перед постановкой до комнатной температуры.

–        Размещение планшет в термостате стопкой.

–        Низкая температура в лабораторных ком­натах (ниже +18°С).

–        Нарушение правил и сроков хранения вскры­тых компонентов при дробном исполь­зо­вании набора.

9. Возможные причины ложноположительных результатов из-за погрешностей постановки

–                Плохая отмывка на стадии конъюгата.

–                Длительное внесение образцов по отношению к времени инкубации.

–        Контаминированный вошер, гребёнка или низкого качества дистиллированная вода.

–        Неправильная работа с пипетками.

–        Неправильное использование плёнки для за­клеивания планшета, при­водящее к подсы­ханию раствора.

–        Многократное использование наконечников и посуды для субстратного раствора (ТМБ).

–        Нерастворённые кристаллы в концентрате от­мывающего раствора.

–        Сыворотки с бактериальным проростом или с наличием клеточных элемен­тов.

10. краткая схема ифа

Использовать только после  ознакомления с инструкцией!

№ п/п	Наименование операции	Время и температура инкубации
1.	В лунку вспомогательного планшета внести 90 мкл РПР–С и внести 10 мкл исследуемой сыворотки	Комнатная температура (18- 25° С)
2.	Внести по 100 мкл ВПК+, НПК+, К-, по 90 мкл РБР-С + 10 мкл анализируемых образцов	30 мин. при 37° С
3.	Промыть однократным ФСБТ – 3 раза	Комнатная температура (18- 25° С)
4.	Внести по 100 мкл РС и ДР	10 мин. при 37° С
5.	Промыть однократным ФСБТ – 2 раза	Комнатная температура (18- 25° С)
6.	Внести по 100 мкл раствора конъюгата в рабочем разведении	30 мин. при 37° С
7.	Промыть однократным ФСБТ – 5 раз	Комнатная температура (18- 25° С)
8.	Внести по 100 мкл рабочего раствора ТМБ	15 мин. при 37° С в защищённом от света месте
9.	Внести по 50 мкл стоп-реагента	Комнатная температура (18- 25° С)
10.	Измерить ОП при 450 нм	Комнатная температура (18- 25° С)