Реферат

Дисбаланс липидов у лиц, предрасположенных к развитию ревматоидного артрита, – возможная связь с банальными инфекциями

, ,

ГБОУ ДПО “Казанская государственная медицинская академия” Минздравсоцразвития России (ректор – )

Учреждение Российской Академии наук “Казанский институт биохимии и биофизики Казанского научного центра РАН” (директор – )

Реферат. Изучали баланс липидов у пациенток с поздним ревматоидным артритом, их предрасположенных к развитию аутоиммунных заболеваний условно здоровых родственниц и здоровых женщин с не отягощенной аутоиммунными заболеваниями наследственностью. Поскольку ранее показано, что родственники больных РА страдают частыми и продолжительными банальными инфекциями, была проанализирована взаимосвязь показателей липидного обмена и параметров инфекционного синдрома. Сыворотка и клетки крови брались на исследование в отсутствие клинических симптомов инфекции (во всех группах) и лабораторных признаков воспалительного процесса (у родственниц и лиц контрольной группы). У лиц, предрасположенных к развитию РА, выявляются проатерогенные сдвиги в составе сывороточных липидов, возможно, связанные с частыми и длительными инфекциями. Перегрузка мононуклеарных лейкоцитов холестерином в этой группе может, в свою очередь, приводить к нарушению функционирования этих клеток и усугублять дефекты противоинфекционной защиты. У больных с поздним РА исследованные показатели липидного баланса близки к возрастной норме.

The lipid dysbalance in the predisposed to rheumatoid arthritis individuals – possible relation with the common infections

M. I. Arleevskaya, A. I. Zabotin, O. M. Semenova, A. P. Tsybulkin

Abstract. We studied some parameters of lipid balance in the patients with advanced rheumatoid arthritis, their predisposed to autoimmune diseases assumed to be healthy first degree female relatives and assumed to be healthy women without inherited predisposition to autoimmune diseases. Since we previously showed that the relatives suffer from frequent and prolonged common infections, the interrelations of the studied factors and the parameters of the infectious syndrome were analyzed. The serum and the blood cells were taken for the study in the periods without any clinical symptoms of infection (in all the groups) and any routine laboratory signs of the inflammatory process (in the relatives and the control group individuals). In the predisposed to autoimmune diseases relatives dyslipidemia was revealed, possibly due to the frequent and prolonged common infections. The overload of mononuclear leucocytes with cholesterol in this group may lead to the functional abnormalities of the cells, and to the deepening of the antiinfectious defense insufficiency. In the patients with the advanced RA the studied factors of lipid balance were close to that in the same age women in the control group.

Ключевые слова: ревматоидный артрит, родственники, инфекции, липиды, монононуклеарные лейкоциты

*****@***ru

Одним из последствий ревматоидного артрита (РА) является ранее развитие атеросклероза. Считается, что проатерогенные сдвиги в составе сывороточных липидов при аутоиммунных заболеваниях являются следствием хронического воспалительного процесса [6]. Наши длительные клинические исследования показали, что родственники больных РА страдают частыми и длительными банальными инфекциями, особенно в течение года, предшествующего дебюту артрита [1]. С развитием РА показатели инфекционного синдрома в течение 3 лет снижаются до контрольных значений

Ближайшие кровные родственники больных РА предрасположены к развитию аутоиммунных заболеваний. Исследование липидного баланса и возможная взаимосвязь его особенностей с инфекциями в этой группе представляет несомненный интерес.

Материалы и методы. Методы клинико – лабораторного обследования 26 пациенток с поздним РА (пРА), 38 условно здоровых родственниц больных РА I степени родства (РОД) и 50 условно здоровых женщин с не отягощенной аутоиммунными заболеваниями наследственностью (ЗК, контроль) подробно представлены в работе [1].

Объекты исследования – сыворотка, моноциты и лимфоциты крови; кровь брали в отсутствие клинических признаков инфекции (во всех группах) и лабораторных маркеров воспалительного процесса (у родственников и лиц контрольной группы).

Клетки выделяли общепринятым методом на градиентах плотности фиколл – урографина. Клеточные мембраны выделяли общепринятым методом [3]. Фракцию, обогащенную плазматическими мембранами, определяли по маркерному ферменту 5`нуклеотидазе. Содержание белка в мембранах клеток определяли с помощью биуретового метода, результаты выражали в г/л в пересчете на 10 клеток.

Концентрацию общего холестерина (ОХС) и холестерина в составе липопротеидов высокой и низкой плотности (ХС-ЛПВП, ХС-ЛПНП) в сыворотке определяли с помощью биохимического анализатора Synchron Cx5 PRO (Beckman Coulter), в клетках – энзиматическим калориметрическим методом с помощью стандартных наборов (Витал, Россия). Перед исследованием ХС-ЛПНП клетки (107) разрушали с помощью ультразвукового дезинтегратора (УЗДН-1, Россия). Содержание ОХС в клеточных мембранах исследовали с помощью флуоресцентного зонда филипина (Sigma, USA), образующего с холестерином комплексы, флюоресцирующие в диапазоне λem = 500-510 нм (λех = 358 нм). Взвеси моноцитов (106 клеток), инкубировали в растворе филипина в концентрациях  10, 20, 30, 40, 50. 60 мкМ/л. Измерения проводили на флуориметре MPF - 44B (Perkin Elmer, USA) в кварцевых микрокюветах.

Оценку микровязкости клеточных мембран проводили с помощью флуоресцентного зонда пирена (Sigma, USA). К взвесям клеток (106) добавляли спиртовый раствор пирена до концентраций 10 15, 30, 60 мкм/л при постоянном перемешивании. Эффективность эксимеризации пирена (коэффициент эксимеризации, КЭ) определяли по отношению интенсивности флуоресценции I460 (эксимеры) / I370 (мономеры), λех = 335 нм. Вязкость прибелковых слоев липидов определяли во взвесях мембран, инкубированных в растворе пирена (15 мкМ), по КЭ при возбуждении флуоресценции λех=285 нм за счет переноса энергии с триптофана. Также определяли интенсивность гашения флуоресценции триптофана пиреном как разницу (%) в интенсивности флуоресценции триптофана при λ=335 нм (λex=285 нм) до и после инкубации мембран с пиреном.

Статистическая обработка: критерий Вилкоксона, двухвыборочный Т-критерий Стъюдента для независимых выборок и регрессионный анализ. Несмотря на малое количество наблюдений, при определении с помощью критерия Колмогорова выборки данных (за исключением сывороточных факторов) имели нормальное распределение.

Результаты. Сывороточные уровни ОХС, ХС-ЛПНП, ХС-ЛПВП и значения индекса атерогенности в обеих контрольных возрастных группах ЗКI и ЗКII соответствуют нормальным показателям, указанным в Рекомендациях ESC/EAS и ВНОК (табл.1) [2,9]. Регрессионный анализ показал, что в контрольной группе частота (3,2±0,4 случаев/год) и продолжительность (23,2±3,3 дня/год) инфекций влияют на содержание сывороточного ОХС (совместно с возрастом) (RІ=0,30, p<0,02), причем, частота инфекций даже без учета возраста оказывает достоверное прямое влияние на этот показатель (RІ=0,30, p<0,006). Обратная гипотеза – о возможном влиянии уровней сывороточных липидов на параметры инфекционного синдрома в контрольной группе не подтвердилась.

У РОД только уровень ХС-ЛПНП несколько превышал предел указанной в Рекомендациях нормы (табл.1). Тем не менее, концентрация ХС-ЛПВП у них была достоверно снижена, а индекс атерогенности в 1,9 раза превышал таковой в сравнимой по возрасту группе ЗКI. Уровень сывороточного ХС-ЛПНП оказался достоверно повышенным только у РОД, подверженных частым (5,6±0,6 случаев/год) и длительным (46,1±7,7 дней/год) банальным инфекциям, тогда как у не склонных к инфекциям лиц этой группы данный показатель не отличался от контрольного. Колебания уровня ХС-ЛВП в обеих подгруппах не выходили за рамки общепринятой нормы, однако были достоверно сниженными по сравнению с полученным нами показателем у лиц контрольной группы. Парадоксальным оказался тот факт, что, вопреки предполагаемому проатерогенному воздействию продолжительных и частых эпизодов воспаления, уровень ХС-ЛПВП оказался наиболее сниженным по сравнению с контролем у не склонных к инфекциям РОД – на 24,6% (разница между двумя подгруппами не достоверна). Причем если зависимость уровня сывороточного ХС-ЛПВП от частоты инфекционных эпизодов была, как и ожидалось, обратной, то зависимость концентрации ХС-ЛПВП от их продолжительности оказалась прямой (коэффициент регрессии 0,71, p<0,01).

В отличие от контроля у предрасположенных к развитию РА лиц регрессионный анализ выявил совместное влияние уровней сывороточных ХС-ЛПВП и ХС-ЛПНП на продолжительность инфекций (RІ=0,34, p<0,03), причем при усложнении модели регрессионного анализа параметром возраста достоверность связи пропадает.

У пациенток с пРА (продолжительность болезни 14,88±12,6 лет) сдвиги в составе липидов также были проатерогенными, однако, в целом полученные данные практически не отличались от таковых в сравнимой по возрасту группе ЗКII (табл.1). Редкие (2,9±0,5 случаев/год) и непродолжительные (22,0±5,6 дней/год) эпизоды инфекций не влияли на показатели липидограммы.

Таблица 1. Уровни сывороточных липопротеидов (M±m) у пациенток с поздним РА (пРА), условно здоровых родственниц (РОД) и условно здоровых женщин с не отягощенной аутоиммунными заболеваниями наследственностью (контроль, ЗК), мМоль/л

Показатели Группы	Возраст (годы)	ОХС	ХС-ЛПВП	ХС-ЛПНП	Индекс атерогенности
ЗКI, n=24	40,26±10,2	4,66±1,1””	1,71±1,9””	2,79±0,9””	1,71±1,9”””
РОД	Все, n=38	41,29±13,6	4,93±1,0*	1,31±0,4*	3,23±1,3*	3,19±1,2***
ИС (+), n=22	41,14±12,7	5,08±0,8**	1,36±0,5	3,42±0,8**	3,13±1,4***
ИС (-), n=16	41,30±11,2	4,81±1,1	1,29±0,5**	2,58±1,6	2,64±1,7*
ЗКII, n=26	52,67±2,5	5,12±1,1	1,29±0,3	3,16±0,8	3,11±1,8
пРА, n=26	52,76±15,0	4,94±1,2	1,15±0,4	3,46±1,3	3,24±2,1

При анализе по критерию Вилкоксона:

“ p< 0,05, ’” p<0,03 ””” p<0,01 при сравнении двух групп ЗК * p< 0,05, ** p<0,03 *** p<0,01 в сравнении с соответствующей по возрасту группой ЗК (ЗКI или ЗКII) ^ p<0,05, ^^p<0,03 ^^^p<0,01  при сравнении с РОД

Мононуклеарные фагоциты играют важную роль в развитии как РА, так и атеросклероза. Аккумуляция ими ЛПНП не регулируется по принципу обратной связи, они легко пересыщаются ХС, превращаясь в пенистые клетки. Именно для них эффективность “откачки” ХС с помощью ЛПВП играет особенно важную роль для обеспечения стабильного уровня внутриклеточного ХС [4]. Мы исследовали содержание ОХС и ХС-ЛПНП в моноцитах, а также в лимфоцитах сосудистого русла (таблица 2). Результаты исследования ХС-ЛПНП в клетках не показаны, так как оказалось, что практически весь определявшийся нами ХС в клетках был связан с ЛПНП.

У здоровых женщин контрольной группы содержание ОХС в клетках с возрастом несколько повышается. В этой группе регрессионный анализ не выявил зависимости содержания ОХС в моноцитах от параметров инфекционного синдрома. Содержание ОХС в лимфоцитах  достоверно зависело от совокупного влияния возраста, частоты и продолжительности инфекций (RI=0,60, p<0,04), причем особенно выраженной была связь с продолжительностью инфекций.

Таблица 2. Содержание ОХС (M±m) в моноцитах и лимфоцитах у пациенток с поздним РА (пРА), их родственниц (РОД) и условно здоровых женщин с не отягощенной аутоиммунными заболеваниями наследственностью (контроль, ЗК), мМоль/л/10х7 клеток

Показатели Группы	Возраст (годы)	ОХС, мМ/л/10х7 клеток
Моноциты	Лимфоциты
ЗКI, n=12	32,3±3,0	0,56±0,06	0,12±0,01
РОД	ИС (-), n=9	35,3±0,5	0,54±0,07	0,60±0,2*
ИС (+), n=10	46,2±4,2	1,15±0,2*	1,14±0,09***
ЗКII, n=8	47,7±3,0	0,62±0,08	0,20±0,06
пРА, n=10	46,3±5,5	0,71±0,07	0,28±0,08

При анализе по 2-х выборочному Т-критерию Стъюдента для независимых выборок:

* p< 0,05, ** p<0,03 *** p<0,01 в сравнении с соответствующей по возрасту группой ЗК (ЗКI или ЗКII)

В подгруппе подверженных инфекциям РОД выявлено достоверное повышение содержания ОХС в моноцитах (в 1,9 раза в сравнении с показателем в контрольной группе сверстниц ЗКII) и – особенно – в лимфоцитах (в 5,7 раза!). У не страдающих инфекциями лиц этой группы содержание ОХС в моноцитах практически совпадало с таковым в группе ЗКI. Однако содержание ОХС в лимфоцитах в этой подгруппе РОД было также достоверно повышено. Регрессионный анализ выявил выраженную прямую зависимость аккумуляции ОХС в моноцитах и продолжительности инфекций (коэффициент регрессии 0,83, p<0,002). При добавлении в модель возраста и частоты инфекций достоверность связи пропадает. В свою очередь, содержание ОХС в моноцитах и лимфоцитах в совокупности оказывало достоверное прямое влияние на продолжительность банальных инфекций в этой группе.

При пРА аккумуляция ОХС мононуклеарами была близка к показателям соответствующей по возрасту контрольной группы. На содержание ОХС в моноцитах больных влияли частота и продолжительность инфекций (RI=0,63, p<0,03), причем, индивидуальная зависимость содержания ОХС от каждого из параметров инфекционного синдрома была обратной и также достоверной (от частоты – коэффициент регрессии = -0,63, p<0,05, от продолжительности – коэффициент регрессии = -0,79, p<0,007).

Проатерогенные сдвиги в метаболизме ХС приводят к его накоплению в клеточных мембранах. В прямом контакте с мембранами ЛПВП забирают на себя излишки ХС из клеток [4]. Исследования содержания ОХС в клеточных мембранах моноцитов больных пРА (n=10), РОД (n=10) и лиц контрольной группы (n=20) проводились с помощью зонда филипина (рис.1). Мембраны моноцитов в старшей контрольной группе ЗКII (53,3±9,9 года) содержали достоверно больше ХС в сравнении с более молодой группой ЗКI (33,4±6,3 года). Содержание ХС в клеточных мембранах моноцитов РОД было повышено в сравнении с контролем, в то время как соответствующие показатели у больных с пРА совпадали с контрольными в большинстве точек концентрационной кривой. При концентрациях филипина в растворе 50 и 60 мкМ/л в группах пРА и РОД в отличие от лиц контрольной группы интенсивность флюоресценции резко падала и затем возрастала. Это свидетельствует о перегрузке мембран молекулами зонда, приводящей к их солюбилизации. Поскольку содержание ХС в мембранах моноцитов больных и родственников явно не снижено, этот эффект может свидетельствовать о снижении содержания либо об особенностях состава мембранных фосфолипидов.

КЭ пирена в клеточных мембранах моноцитов и лимфоцитов РОД во всех точках концентрационных кривых были достоверно снижены в сравнении с ЗКI, что свидетельствует об их повышенной вязкости (рис.2,3). При возбуждении флуоресценции метки посредством индуктивно-резонансного переноса энергии с триптофановых остатков мембранных белков выявилось выраженное снижение КЭ пирена в прибелковых слоях липидов. Гашение флуоресценции триптофана пиреном у РОД было заметно снижено.

У больных пРА вязкость клеточных мембран моноцитов абсолютно совпадала с контролем. Однако, и в этой группе вязкость прибелковых слоев, хотя и приблизилась к возрастной норме, оставалась достоверно повышенной. В то же время клеточные мембраны лимфоцитов в этой группе оказались достоверно менее вязкими, что, вероятно, отражает наличие в исследуемой популяции большого количества активных клеток. Состояние прибелковых слоев липидов в этих клетках не отличалось от нормы.

Таким образом, у лиц, предрасположенных к развитию РА в отсутствие клинических и лабораторных признаков воспалительного процесса выявились признаки дисбаланса липидов. Наши данные согласуются с результатами единичных исследований, согласно которым дислипидемия обнаруживается уже у здоровых доноров, у которых позднее развился РА [7]. Возможно, эти нарушения в составе липидов обусловлены характерными для этой группы частыми и длительными банальными инфекциями.

Ранее мы показали, что даже в отсутствие клинических признаков инфекции и лабораторных признаков воспалительного процесса у родственников повышены уровни провоспалительных цитокинов в крови [5]. Длительно повышенные уровни этих цитокинов, способствующие, как известно, формированию пенистых клеток, возможно, обуславливают накопление ОХС в мононуклеарных клетках в данной группе [8], Накопление ОХС в клетках может быть обусловлено также наличием в сосудистом русле модифицированных в процессе частых продолжительных инфекций ЛПВП со сниженной способностью к захвату излишков внутриклеточного ХС [10]. В свою очередь, перегрузка мононуклеарных клеток ХС может приводить к нарушению их функционирования и усугублять дефекты противоинфекционной защиты. В частности, ранее мы продемонстрировали нарушения функционирования моноцитов больных РА и их родственников – замедленную интернализацию этими клетками объектов фагоцитоза [5]. Возможно, одной из причин этого дефекта является повышенная вязкость клеточных мембран, а также, особенности взаимодействия мембранных белков с прибелковыми слоями липидов, затрудняющие конформационные изменения встроенных в мембраны белковых молекул и передачу активационных сигналов внутрь клеток.

У больных с поздним РА исследованные показатели липидного баланса близки к возрастной норме. В связи с этим привлекает внимание тот факт, что, хотя смертность от сердечно – сосудистых заболеваний при РА превышает популяционные показатели во всех возрастных группах, это превышение наиболее ощутимо в возрасте от 18 до 39 лет с последующим постепенным снижением [11]. Возможно, пережившие возрастной пик смертности от сердечно – сосудистых заболеваний больные РА – люди, менее подвержены развитию атеросклероза, даже несмотря на наличие воспалительного процесса в суставах, состав их сывороточный липидов оказался близким к нормальным возрастным показателям.

Литература

, , //Иммунология, 2011. Том 32, № 1. С. 24-30. , , и др. Диагностика и коррекция нарушений липидного обмена с целью профилактики и лечения атеросклероза. Рекомендации Всероссийского научного общества кардиологов, Москва, 2009, http://athero. ru/Lipids-rus-2009.pdf Финдлей Дж. Б., Уванз мембраны. Методы. Мир, 1990 , Никуличева липидов и липопротеидов и его нарушения. СПб, Питер, 1999. Arleevskaya MI, Gabdoulkhakova AG, Filina JV, Zabotin AI, Tsibulkin AP. //Open Rheumatol J., 2011. №5. P. 36-44 Del Rincуn I, O'Leary DH, Freeman GL, Escalante A. //Atherosclerosis, 2007. Vol. 195, № 2. P. 354-60. van Halm V P, Nielen M M J, Nurmohamed M T, et al //Ann Rheum Dis, 2007. Vol. 66, № 2. P. 184–18. Persson J, Nilsson J, Lindholm MW. //BMC Immunol, 2008. №9. P. 70 – 81 Reiner Z., Catapano A. L., De Backer G., et al. // European Heart Journal, 2011. Vol. 32. P. 1769–1818. Smith JD. //J Clin Lipidol. 2010 ; 4(5): 382–388 Solomon D. H., Goodson N. J., Katz J. N., et al. //Ann Rheum Dis, 2006; Vol. 65, № 12. P. 1608-12.

Рисунок 1. Зависимость флуоресценции комплексов “холестерин - филипин” в клеточных мембранах моноцитов больных поздним РА, их родственниц и здоровых женщин с не отягощенной аутоиммунными заболеваниями наследственностью, уе

Ось Х – [C] филипина в растворе, мкМ/л,

Ось Υ – интенсивность флуоресценции комплексов “холестерин – филипин”, условные единицы

Различия достоверны (Т-критерий Стъюдента):

* при сравнении между показателями двух групп;

“ при сравнении двух соседних точек на кривой данной группы

ЗКI – здоровые женщины с не отягощенной аутоиммунными заболеваниями наследственностью (n=8), средний возраст 33,4±6,3 года

ЗКII – здоровые женщины с не отягощенной аутоиммунными заболеваниями наследственностью (n=8), средний возраст 53,3±9,9

РОД – условно здоровые родственницы больных РА, подверженные частым и продолжительным инфекциям (n=10), средний возраст 35,3±9,1 года

РА – больные поздним РА (n=10), средний возраст 53,2±12,7 года

Рисунок 2. Коэффициент эксимеризации пирена в клеточных мембранах моноцитов (а), в прибелковых слоях клеточных мембран моноцитов (б) и интенсивность гашения флюоресценции триптофана при внесении пирена в прибелковых слоях моноцитов, % (в) больных поздним РА, их родственниц и здоровых женщин с не отягощенной аутоиммунными заболеваниями наследственностью

Содержание белка в мембранах клеток было сравнимым в 3 группах

Рисунок 2а

Ось Х – концентрация пирена в растворе, мкМ/л,

Ось Υ – коэффициент эксимеризации пирена (отношение флуоресценции эксимеров 460 нм  /мономеров 370 нм, λех=335нм) в клеточных мембранах моноцитов

Рисунок 2б

Ось Υ – коэффициент эксимеризации пирена (отношение флуоресценции эксимеров 460 нм  /мономеров 370 нм, λех=285 нм) в прибелковых слоях клеточных мембран моноцитов

Рисунок 2в

Ось Υ – Интенсивность гашения флуоресценции триптофана в прибелковых слоях мембран моноцитов при внесении пирена во взвеси (%)

ЗКI – здоровые женщины с не отягощенной аутоиммунными заболеваниями наследственностью (n=10), средний возраст 33,4±6,3 года

ЗКII – здоровые женщины с не отягощенной аутоиммунными заболеваниями наследственностью (n=10), средний возраст 53,3±9,9

РОД – условно здоровые родственницы больных РА, подверженные частым и продолжительным инфекциям (n=10), средний возраст 35,3±9,1 года

РА – больные поздним РА (n=10), средний возраст 53,2±12,7 года

Рисунок 3. Коэффициент эксимеризации пирена в клеточных мембранах лимфоцитов (а), в прибелковых слоях клеточных мембран лимфоцитов (б) и интенсивность гашения флуоресценции триптофана при внесении пирена в прибелковых слоях лимфоцитов, % (в) больных поздним РА, их родственниц и здоровых женщин с не отягощенной аутоиммунными заболеваниями наследственностью

Содержание белка в мембранах клеток было сравнимым в 3 группах

Рисунок 3а

Ось Х – концентрация пирена в растворе, мкМ/л,

Ось Υ – коэффициент эксимеризации пирена (отношение флуоресценции эксимеров 460 нм  /мономеров 370 нм, λех=335нм) в клеточных мембранах лимфоцитов

Рисунок 3б

Ось Υ – коэффициент эксимеризации пирена (отношение флуоресценции эксимеров 460 нм  /мономеров 370 нм, λех=285 нм) в прибелковых слоях клеточных мембран моноцитов

Рисунок 3в

Ось Υ – Интенсивность гашения флуоресценции триптофана в прибелковых слоях мембран лимфоцитов при внесении пирена во взвеси (%)

ЗКI – здоровые женщины с не отягощенной аутоиммунными заболеваниями наследственностью (n=8), средний возраст 33,4±6,3 года

Различия достоверны (Т-критерий Стъюдента):

* при сравнении между показателями двух групп;

“ при сравнении двух соседних точек на кривой данной группы

ЗКI – здоровые женщины с не отягощенной аутоиммунными заболеваниями наследственностью (n=8), средний возраст 33,4±6,3 года

ЗКII – здоровые женщины с не отягощенной аутоиммунными заболеваниями наследственностью (n=8), средний возраст 53,3±9,9 года

РОД – условно здоровые родственницы больных РА, подверженные частым и продолжительным инфекциям (n=10), средний возраст 35,3±9,1 года

РА – больные поздним РА (n=10), средний возраст 53,2±12,7

Arleevskaya M. I.

Адрес: 420012, Казань, ул. Муштари, д. 11, Госмедакадемия, ЦНИЛ

Тел. [phone]

E-mail: *****@***ru

Zabotin A. I.

Gabdoulkhakova A. G.

Semenova O. M.

Tsybulkin A. P.