Ассоциация и сравнительный анализ СК с вирусом папиломы человека у иммуносупрессивных и иммунокомпетентных пациентов

АССОЦИАЦИЯ И СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ СК С ВИРУСОМ ПАПИЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА У ИММУНОСУПРЕССИВНЫХ И ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ ПАЦИЕНТОВ.

1, 2, 3

№Отделение дерматовенерологии и дерматоонкологии (руководитель – ) ГБУЗ МО МОНИКИ им. ;

2Кафедра кожных и венерических болезней (зав. – ) ГОУ ВПО ФППОВ Первый МГМУ им. ;

3Клиника «Премиум Эстетикс», г. Москва

Резюме к статье

Многочисленные данные указывают на роль вируса папилломы человека (ВПЧ) рода beta в развитии эпителиальных опухолей кожи. Цель нашего исследования - изучить ассоциацию себорейного кератоза (СК) с ВПЧ на основе анализа ДНК ВПЧ рода beta, в том числе у иммуносупрессивных лиц. Обследовано 20 реципиентов почечного трансплантата (РПТ) и 22 иммунокомпетентных пациента с СК. Контрольная группа представлена 49 добровольцами без кожных опухолей. Детекцию ДНК ВПЧ рода beta в и здоровой коже проводили методом ПЦР real-time. Показана высокая выявляемость ДНК ВПЧ у РПТ как в очагах СК, так и в видимо здоровой коже (81% и 55% случаев соответственно), что превышало встречаемость вируса в здоровой коже доноров (47% случаев). Вирусная нагрузка в очагах СК была выше, чем в здоровой коже лиц контрольной группы.

Ключевые слова: вирус папилломы человека рода beta, себорейный кератоз, реципиенты почечного трансплантата, иммуносупрессия.

Эпителиальные опухоли кожи – одна из самых распространенных групп опухолей человека, отличающаяся значительным разнообразием. Изучение их этиологии и патогенеза представляет значительный интерес для оптимизации лечения и профилактики этих опухолей.

Провоцировать развитие эпителиальных опухолей может интенсивная инсоляция, химические канцерогены. Определенную роль отводят наследственным и иммунологическим нарушениям. В настоящее время в связи с достижениями в области молекулярной биологии предпринимаются попытки определения роли вируса папилломы человека (ВПЧ) рода beta в развитии отдельных вариантов эпителиальных опухолей кожи – плоскоклеточного рака, базальноклеточного рака, актинического кератоза, кератоакантомы, себорейного кератоза (СК) [2, 5].

Обнаружение ВПЧ рода beta в эпителиальных опухолях может быть следствием как активной вирусной инфекции, так и независимой бессимптомной персистенции, характерной для факторов естественной резистентности. Поэтому, помимо выявления ВПЧ рода beta, необходимо проводить количественное измерение вирусной нагрузки, определение которой является сравнительно новым подходом в диагностике ВПЧ-инфекции для мониторинга дальнейшего лечения и профилактики[1].

Отсутствие в большинстве очагов транскрипционной активности и низкая вирусная нагрузка, сопоставимая с таковой в здоровой коже, противоречат предположению о роли ВПЧ в стимуляции опухолевого роста. Тем не менее, ряд популяционных исследований, молекулярные и патоморфологические данные подтверждают, что ВПЧ рода beta могут играть этиологическую роль в развитии эпителиальных опухолей [3, 4, 8]. Иммуносупрессия также является важным кофактором развития эпителиальных образований кожи. Формирование ВПЧ-ассоциированных бородавок, ороговевающих кожных опухолей (в том числе СК) и немеланомных видов рака кожи значимо повышается после трансплантации внутренних органов[1].

СК – распространенная доброкачественная ЭОК неизвестной этиологии. Из-за схожей с бородавками морфологической картины, ВПЧ рассматривается как один из возможных этиолологическоих факторов данных опухолей. Ассоциация ВПЧ с негенитальным СК была подтверждена в ряде исследований. Zhao et al. обнаружили ВПЧ в 4 из 89 СК методом световой и электронной микроскопии [9]. Li et al. обнаружили ВПЧ рода beta в 42 из 55 (76%) биоптатах СК у РПТ по сравнению с 13 из 48 (27%) образцами здоровой кожи (p<0,005) [6]. Наряду с этими результатами в ряде исследований, в основном с использованием менее чувствительных разновидностей ПЦР, ДНК ВПЧ в СК обнаружить не удалось[7].

С учетом вышеизложенного, проведение исследований, изучающих ассоциацию ВПЧ с различными формами эпителиальных образований кожи (доброкачественными, предраковыми и злокачественными) на основе количественного определения ДНК ВПЧ, является актуальной задачей дерматоонкологии, решение которой будет способствовать дальнейшему пониманию взаимосвязей эпителиальных образований кожи с ВПЧ.

Цель исследования: изучить ассоциацию СК с ВПЧ на основе количественного анализа ДНК ВПЧ.

Задачи исследования:

Исследовать встречаемость ДНК ВПЧ рода beta в СК и видимо здоровой коже РПТ и иммунокомпетентных пациентов. Изучить вирусную нагрузку ДНК ВПЧ рода beta в СК и видимо здоровой коже РПТ и иммунокомпетентных лиц.

Материалы и методы.

Всего на базе отделений дерматовенерологии и дерматоонкологии, а также хронического гемодиализа и трансплантации почки МОНИКИ им. было обследовано 60 РПТ, у 20 из них имелись множественные СК. Было произведено исследование из очагов СК (всего 21 очаг) и видимо здоровой кожи области плеча. Также были обследованы 22 иммунокомпетентных пациентов с СК. Аналогично у каждого иммунокомпетентного пациента была взята для анализа видимо здоровая кожа.

Среди 20 РПТ было 10 мужчин и 10 женщин в возрасте 46±10 лет (от 22 до 60). Длительность иммуносупрессии составила от полугода до 13,5 лет (медиана – 3 года). 16 пациентов РПТ получали микофенолата мофетил, такролимус и преднизолон и 4 – циклоспорин А в комбинации с другими иммуносупрессивными препаратами.

Среди иммунокомпетентных лиц с СК было 11 мужчины и 11 женщин в возрасте 43±15 лет (от 24 до 78).

Контрольная группа представлена 49 добровольцами, из них 29 мужчин и 20 женщин в возрасте 39±13 лет, у которых кожные заболевания, в том числе ассоциированные с кожными типами ВПЧ, отсутствовали.

Статистическая обработка полученных данных проводилась при помощи пакета программ Statistica 10.0. Достоверность различия частот определяли при помощи критерия «хи-квадрат». Для анализа характерных вирусных нагрузок рассчитывали десятичный логарифм количества вирусов; сравнение несвязанных выборок осуществляли с использованием критерия Манна-Уитни, связанных - с помощью критерия Вилкоксона. Различия считались статистически значимыми при р<0,05.

Генодиагностика ВПЧ-инфекции проводилась на базе ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора[1]. Материал забирали в стерильных условиях борами (микробиоптаты), помещали в пробирки с транспортной средой и хранили при температуре -70 ̊С. Пробоподготовка проводилась методом обработки ткани протеиназой К с последующим выделением методом аффинной сорбции на силикагеле.

Определение ДНК ВПЧ рода beta и ДНК человек в биоптатах осуществлялось методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (Real-Time). Амплификация и детекция проводилась на приборе «Rotor-Gene» 3000 («Corbett Research», Австралия).

Для количественного определения ВПЧ рода beta, а так же оценки ее чувствительности и специфичности использовали рекомбинантные плазмидные положительные контроли, содержащие последовательность полных геномов ВПЧ кожных типов рода alpha, gamma, mu, nu и beta и контрольные плазмиды фрагмента в-глобинового гена человека.

Для выявления ДНК ВПЧ рода beta использовались четыре системы олигонуклеотидов (группоспецифических праймеров и зондов):

1-я - для выявления генотипов вида в1 (5, 8, 12, 14, 21, 19, 25, 47, 36);

2-я - для выявления генотипов вида в2 (9, 15, 17, 22, 23, 38, 37, 80);

3-я - для выявления генотипов вида в3 (49, 75, 76);

4-я - для выявления генотипов вида в4 (92), в5 (96), в1 (20,24 и 93 типы).

Во все четыре системы введены олигонуклеотиды для выявления и количественного определения ДНК человека (по Я-глобиновому гену человека), что позволяло проводить оценку адекватности забора, хранения и обработки образцов (принцип внутреннего контроля).

С учетом того, что при взятии клинического материала из очагов СК и здоровой кожи количество попадающих в образец эпителиальных клеток (а соответственно и копий вируса) варьировало, использовалась методика нормирования количества вируса на количество клеток человека. Расчет нормализованной вирусной нагрузки производился по формуле: вирусная нагрузка = lg ((кол-во ДНК ВПЧ / кол-во ДНК чел.) Ч 105)[1].

Результаты

Полученные данные представлены в виде таблицы.

Таблица №1. Выявляемость ДНК ВПЧ рода beta в СК и образцах видимо здоровой кожи.

Исследуемые образцы	Кол-во образцов	Количество ВПЧ - образцов	Количество ВПЧ + образцов
Абс.	%	Абс.	%
иммуносупрессивные	СК	21	4	19%	17	81%
Видимо здоровая кожа у лиц с СК	20	9	45%	11	55%
иммунокомпетентные	СК	22	8	36%	14	64%
Видимо здоровая кожа у лиц с СК	22	13	59%	9	41%
Здоровая кожа доноров	49	26	53%	23	47%

Анализ предварительных данных показал, что у РПТ кератотические очаги появляются как на открытых, так и на закрытых участках кожи.

В СК и видимо здоровой коже РПТ с высокой частотой выявляли ДНК ВПЧ рода beta - 81% и 55% случаев соответственно, что значимо выше по сравнению с кожей здоровых доноров – в 47% случаев. В СК и видимо здоровой коже иммунокомпетентных лиц ВПЧ обнаруживали реже – в 64% и 41% случаев, соответственно.

Вирусная нагрузка ДНК ВПЧ рода beta в СК и видимо здоровой коже РПТ составила 2,8(1,9;5,4) и 2,0(1,3;2,5), соответственно (данные представлены в виде медиана(25 перцентиль;75 перцентиль)). Сходные результаты были получены относительно вирусной нагрузки в СК и видимо здоровой коже иммунокомпетентных лиц: 1,8(1,2;2,3) и 2,2(1,6;1,8), соответственно. Вирусная нагрузка ДНК ВПЧ в здоровой коже доноров была значимо ниже и составила 1,5(0,9;1,9).

У РПТ с единичным СК (от 1 до 5 очагов по всему телу) ДНК ВПЧ рода beta обнаруживали в 43% случаев. При множественных очагах СК (от 5 и более) у РПТ отмечалась тенденция к более частому обнаружению ДНК ВПЧ рода beta - в 91% случаев.

Сохраняется пробел в нашем понимании как взаимосвязи между ВПЧ и эпителиальными опухолями, так и механизмов, за счет которых ВПЧ может вызывать их развитие. Невозможность выявить ВПЧ во всех подобных опухолях, вероятно, связана с ограничениями используемых методик молекулярной диагностики, при этом количественный анализ вирусных геномов позволяет более объективно судить о характере присутствия ВПЧ в опухолях кожи. Необходимо больше исследований для подтверждения или опровержения роли ВПЧ рода beta в развитии эпителиальных опухолей в общей популяции и особенно среди иммуносупрессивных лиц.

Список литературы

1. , , Козлова кожных типов вирусов папилломы человека в опухолях кожи // Альманах клинической медицины. Издательство: Московский областной научно-исследовательский институт им. (Москва). ‒ 2006. № 9. ‒ C. 44-50.

2. Accardi R., Gheit T. Cutaneous HPV and skin cancer // Presse Med. ‒ 2014. ‒ Vol. 43, № 12P2. ‒ P. e435-e443.

3. Borgogna C., Lanfredini S., Peretti A., De Andrea M., Zavattaro E., Colombo E., Quaglia M., Boldorini R., Miglio U., Doorbar J., Bavinck J. N., Quint K. D., de Koning M. N., Landolfo S., Gariglio M. Improved detection reveals active beta-papillomavirus infection in skin lesions from kidney transplant recipients // Mod Pathol. ‒ 2014. ‒ Vol. 27, № 8. ‒ P. 1101-15.

4. Farzan S. F., Waterboer T., Gui J., Nelson H. H., Li Z., Michael K. M., Perry A. E., Spencer S. K., Demidenko E., Green A. C., Pawlita M., Karagas M. R. Cutaneous alpha, beta and gamma human papillomaviruses in relation to squamous cell carcinoma of the skin: a population-based study // Int J Cancer. ‒ 2013. ‒ Vol. 133, № 7. ‒ P. 1713-20.

5. IARC. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans.

Human Papillomaviruses. Lyon. //. ‒ 2012. ‒ Vol. 90.

6. Li Y. H., Chen G., Dong X. P., Chen H. D. Detection of epidermodysplasia verruciformis-associated human papillomavirus DNA in nongenital seborrhoeic keratosis // Br J Dermatol. ‒ 2004. ‒ Vol. 151, № 5. ‒ P. 1060-5.

7. Meibodi N. T., Nahidi Y., Meshkat Z., Esmaili H., Gharib M., Gholoobi A. No Evidence of Human Papillomaviruses in Non-genital Seborrheic Keratosis // Indian J Dermatol. ‒ 2013. ‒ Vol. 58, № 4. ‒ P. 326.

8. Quint K. D., Genders R. E., de Koning M. N., Borgogna C., Gariglio M., Bouwes Bavinck J. N., Doorbar J., Feltkamp M. C. Human Beta-papillomavirus infection and keratinocyte carcinomas // J Pathol. ‒ 2015. ‒ Vol. 235, № 2. ‒ P. 342-54.

9. Zhao Y. K., Lin Y. X., Luo R. Y., Huang X. Y., Liu M. Z., Xia M., Jin H. Human papillomavirus (HPV) infection in seborrheic keratosis // Am J Dermatopathol. ‒ 1990. ‒ Vol. 11, № 3. ‒ P. 209-12.

Авторы

(Korneva L. V.) - к. м.н., ассистент кафедры дерматовенерологии и дерматоонкологии ФУВ ГБУЗ МО МОНИКИ им. .

Тел. [phone]; e-mail:*****@***ru

(Snarskaya E. S.) – д. м.н., профессор кафедры кожных и венерических болезней ГОУ ВПО ФППОВ Первый МГМУ им. .

Тел. [phone];

(Polyanskaya A. A.) – врач дерматовенеролог, косметолог, , клиника «Премиум Эстетикс».

Тел. [phone]