СОСТОЯНИЕ ВОДЫ НА НАЧАЛЬНЫХ ЭТАПАХ НАБУХАНИЯ СЕМЯН СОИ В СВЯЗИ С ОПРЕДЕЛЕНИЕМ МАСЛИЧНОСТИ СЕМЯН:  ИССЛЕДОВАНИЕ МЕТОДАМИ МАГНИТНОГО РЕЗОНАНСА

Олег Харчук1, Александр Кириллов1, Сергей Аксенов2, Алексей Смирнов2, Семен Тома1

1Институт генетики и физиологии растений АН РМ, 2002, Молдова, Кишинев, ул. , kharchuk. *****@***ru  2Биологический факультет МГУ им. , 119992, Россия, Москва, Воробьевы горы,  д. 1, корп. 12

The first stages of soybean seed swelling were investigated by NMR and EPR methods. It was shown by EPR-tomography method, that primary water amount enter embrio region of the seed. The free water fraction appears upon local water concentration higher than 20% of seed dry weight. The state of first 20% seed water content is able to change from free (macrocapilar space) to bound (perhaps, in endosperm) during  10-20 hours of swelling. The particularities of NMR-relaxation nondestructive oil determination depend on total water content and water state changes during swelling. The oil of wet seeds (moisture content 20-40%)  is possible to be determined  from slowly decaying component of NMR-relaxation curve.

Введение. Изменение состояния воды при набухании и расходование запасных  веществ (для сои - прежде всего масел - основные факторы прорастания семян [1,2].  В последние десятилетия основным недеструктивным методом определения состояния воды и содержания масла в индивидуальных семенах является метод ЯМР-релаксации [3-8]. Важным методическим (для правильного количественного  разделения фракций воды и масла в семенах)  и физиологическим (связывает режим увлажнения и расход запасных веществ семени при прорастании) показателем является минимальный уровень влажности семян, соответствующий  появлению и сохранению фракции свободной воды – по разным оценкам, от 15 до 25% массы семян [1, 9-11]. Рабочей гипотезой настоящей работы являлось реальная предположение, что состояние воды при этом пороговом уровне влажности не является постоянным, а меняется в динамике взаимодействия  первых  поступающих количеств воды с сухим веществом семян сои, из чего и вытекала цель  работы – изучить состояние первых количеств воды, поступающей в семена сои, а также  установить особенности дифференциации водной и масличной компонент ЯМР-релаксации в зависимости от влажности семян.

НЕ нашли? Не то? Что вы ищете?

Материалы и методы. Объект исследования - семена сои Glycine max L., сорт Букурия. Кривые ЯМР-релаксации от индивидуальных семян регистрировали с использованием импульсной последовательности 90°-ф-180°-2ф-180°-2ф-…[13] при ф 0,16 мсек.  Суммарные кривые ЯМР-релаксации разделяли на компоненты по методу, первоначально предложенному для выделенгия из суммарной кривой радиоактивного распада отдельных экспоненциальных кривых для ядер с различным временем жизни [14], однако по другому критерию: разной скорости спин-спиновой релаксации (Т2) протонов [15-17]. В качестве стандартов использовали образцы линолевой кислоты, соевого масла, воды и глицерина. При использовании метода ЭПР области семян с повышенной проницаемостью для водного раствора фиксировали с помощью хорошо растворимого в воде нитроксильного радикала С9Н18NО2. После экспозиции воздушно-сухих семяна сои в 0,06 М водном растворе зонда на 30-50 мин. семена помещали в сосуд с жидким азотом, что позволило проводить измерения на целом семени, при этом пространственное разрешение реконструктивной ЭПР-томографии достигает 10-100 мкм [18]. 

Результаты и обсуждение. На Рис.1 показано в трехмерном изображении, что на начальном этапе поступление  воды в семя происходит со стороны семенного рубчика, т. е. в первую очередь фронт свободной воды  увлажнят зародыш семени. Эти данные согла-

  Рис. 1.  ЭПР-томограмма начальной стадии набухания семени массой 20 мг с орошаемого растения сои с. Букурия.

суются с выводами по семенам пшеницы, где в первые часы набухания вода заполняет преимущественно область зародыша [1, 17]. В дальнейшем свободная вода заполняет макрокапиллярное пространство всего семени (Рис.2). Нами изучено состояние

  Рис. 2.  ЭПР-томограмма начальной стадии набухания семени массой 40 мг с неорошаемого растения сои с. Букурия.

воды в семенах сои при прохождении  порогового для прорастания семян уровня влажности (~ 20% сухой массы) в разных направлениях: изменения влажности семени: набухании до 50% - ной влажности и обратном высушивании (Табл. 1). Как следует из приведенных данных, при одинаковой влажности семян 19,7% состояние воды в семенах сои разное в зависимости от направления изменения влажности (набухание или подсушивание).

В процессе набухания регистрируется в 5 раз больше относительно подвижной воды (15% против 3% при обратном подсушивании). Это связано с неоднородностью увлажнения семени на начальных этапах набухания: совмещение микрокапиллярных пространств со свободной водой и практически неувлажненных компартментов эндосперма. В обратном процессе подсушивания те же 19,7% воды соответствую равномерно распределенной по эндоспермы воде, находящейся преимущественно в связанном состоянии. Ранее подобный характер изменения состояния воды в семенах наблюдали на пшенице и (1986): вода, поступившая в семена пшеницы в первые часы набухания, в последующем перераспределяется внутри зерновки и связывается клеточными структурами, что приводит к заметному падению интенсивности дыхания и только

Таблица 1. Содержание воды в семенах сои и ЯМР-релаксация протонов.

Медленнозатухающую компоненту выделяли как амплитуды сигнала спинового эха в диапазоне времен наблюдения 20-80 мсек с последующей экстраполяцией амплитуд к нулевому времени наблюдения. Быстрозатухающую компоненту опреляли вычитанием медленнозатухающей компоненты из суммарной кривой спада сигналов спинового эха включающий диапазон времен наблюдения 3-8 мсек). Амплитуда (Ао) приведена в мг воды на 100 мг сухой массы семян, а время спин-спиновой релаксации протонов (Т2) в мсек.


Дата и состояние семян

Содержание воды в семенах, % сухой массы

Параметры ЯМР-релаксации протонов семян (регистрация при ф = 0,16 мсек )

Медленно-затухающая (масляная) компонента

Быстро-затухающая (водно-масляная)  компонента

Ао

Т2

Ао

Т2

25.02.2008: нативные семена

8,7

15 ± 1

71  ± 10

3  ± 2

24  ± 19

26.02.2008: набухание 10 часов

19,7

16 ± 1

62  ± 4

18  ± 4

4  ± 1

27.02.2008: завершение (26 часов) набухания и перевод на подсушивание

50,0

18 ± 2

56  ± 1

34  ± 2

7  ± 1

27.02.2008: подсушивание

19,7

15 ± 1

83  ± 21

6 ± 1

9  ± 2

4.03.2008 : высушены до постоянного веса при 105 °С

0

15  ± 0

59  ± 7

3  ± 1

16  ± 5

после увлажнения выше 20-25% воды (к сухой массе) (для крахмалистых семян пшеницы это 5-6 часов) свободная вода после установления равновесного  распределения сохраняется не только в зародыше, но и в эндосперме, с  увеличением интенсивности дыхания [1].  Как видно из Табл. 1, разное состояние воды при одинаковой влажности семян сои должно учитываться при выборе способа определения масличности семян: на первых этапах набухания. При наличии большого количества свободной воды, накладывающейся на ЯМР-релаксацию тех протонов масла, у которых величины Т2 минимальны, более предпочтительным является определение масличности по медленнозатухающей масличной компоненте с использованием поправочных коэффициентов по калибровочной кривой (этот способ применим для высокой влажности семян. вплоть до 40%). Для сухих семян и малоувлажненных (менее 20%) семян с уравновешенным по всему объему распределением воды масличность предпочтительнее  определять суммированием масличных компонент с разными временами Т2 , подбирая соответствующий режим регистрации кривых ЯМР-релаксации. 

Библиография.

, , 1986. Особенности поступления и распределения воды в семенах пшеницы при ее набухании.//Физиология растений, т.33, с. 150-158.   2005. Применение метода ЯМР-релаксации для определения содержания масла в семенах сои. Materialele conferentei єiinюifico-metodice Invaюamantul universitar din Republica Moldova la 75 ani, Chiєinau, 11-12 oct., vol.2,  р.102-105. , ,1966. Определение масла в семенах сои при помощи ядерного магнитного резонанса. ДАН СССР, 167, № 1, 225-227 Gambhir P. N. Agarwala  A. K., 1985.  Simultaneous Determination of Moisture and Oil Content In Oilseeds by Pulsed Nuclear Magnetic Resonance. Journal of the American Oil Chemistsґ Society, Vol. 62, no. 1, р. 103-108 Rutar V., 1989. Magic Angle Sample Spinning NMR Spectroscopy of Liquids as a Nondestructive Method for Studies of Plant Seeds. J. Agric. Food Chem. 1989, 37, 67-70. Krishnan P. , D. K. Joshi, M. Maheswari, S. Nagarajan and A. V. Moharir, 2004a. Characterisation of Soybean and Wheat Seeds by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. Biologia Plantarum, vol. 48, n.1, 117-120 Љimiж B., Popoviж R., Sudariж A., Rozman V., Kalinoviж I., Жosiж J., 2007. Influence of Storage Condition on Seed Oil Content of Maize, Soybean and Sunflower. Agriculturae Conspectus Scientificus | Vol. 72 (2007) No. 3, р. 211-213. , , 2007. Применение метода ЯМР в изучении фенотипического и генотипического разнообразия сои по показателю масличности семян// Генетические ресурсы культурных растений в XXI веке: состояние, проблемы, перспективы (тезисы докладов II Вавиловской международной конференции),  Санкт-Петербург, 26-30 ноября 2007 г.), СПб.: ВИР, 2007. – 622с.; стр. 365-366. Desbois P., Le Botlan D., 1994. Proton Low-Field NMR Measurements on Crackers. Journal of Food Science 59 (5), p.1088–1090. Ridenour C. F., Xiong J., Maciel G. E., 1996. Investigation of Germination and Aging in Moravian Ill Barley Grain by Nuclear Magnetic Resonance. Biophysical Journal, Vol. 70, р.511-531. Krishnan P., D. K. Joshi, S. Nagarajan and A. V. Moharir, 2004b. Characterisation of germinating and non-germinating wheat seeds by nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. European Biophysical Journal, vol. 33, number 1, 76-82. Krishnan P., D. K. Joshi, S. Nagarajan and A. V. Moharir, 2004c. Characterisation of germinating and non-viable  seeds by nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. Seed Science Research (2004), 14:355-362. Carr H. Y., Purcell E. M., 1954. Effects of diffusion on free procession in nuclear magnetic resonance experiments. , v.94, p.630-638 Bleuler  E., Goldsmith G., 1952. Experimental nucleonic. New York, Reinhardt. Аксенов C. И., .1972. Исследование состояния воды в биологических объектах с малой влажностью методом спинового эха. В сб. «Связанная вода в дисперсных системах», вып.2, Москва, МГУ, стр.154-167. 1974. Исследование конформационной подвижности белка и состояния воды в биоструктурах методом спинового эха ЯМР. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Москва, МГУ, 24 стр. , 1983. Роль состояния воды в активации метаболизма на начальных этапах прорастания семян. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Москва, МГУ, 24 стр , , 1983. ЭПР-томография//Химическая физика, Т.2, с. 445

Цитировать: О. Харчук, А. Кириллов, С. Аксенов, А. Смирнов, С. Тома. Состояние воды на начальных этапах набухания семян сои в связи с определением масличности семян: исследование методами магнитного резонанса. Оn: "Agrobiodiversitatea vegetalг оn R. Moldova: evaluarea, conservarea єi utilizarea", Tipografia AЄM, Chiєinгu, 2008, р. 425-430