МЕТОДИКИ, РЕАГЕНТЫ И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ ТЕСТА "ПРОТРОМБИНОВОЕ ВРЕМЯ"
С. Баркаган,
Лаборатория гемостаза Алтайского Гематологического Центра, г. Барнаул
Протромбиновый тест (ПТ) принадлежит, как известно, к числу наиболее распространенных методов лабораторной диагностики и применяется при исследовании патологии системы свертывания крови. Он выполняется практически во всех лабораториях, его назначают в составе скрининговых схем обследования. Тем не менее, несмотря на огромный практический опыт применения ПТ, назрела необходимость серьезного пересмотра показаний и условий для его выполнения, особенностей учета результатов, распространенных в настоящее время в России.
К стандартизации ПТ мы обращаемся на 15 лет позже, чем это было сделано в западно-европейских и других цивилизованных странах. Однако, этим надо заниматься, поскольку существующее положение пока исключает контроль качества ПТ в нашей стране. Основная причина неподконтрольности ПТ - в отсутствии учета чувствительности большинства применяемых тромбопластинов к дефициту факторов протромбинового комплекса при оценке результатов анализа.
Отечественные разработки
Это не значит, что отечественные специалисты не поднимали вопрос о стандартизации ПТ. Принципиально важны сравнительно недавние публикации и (Клиническая лабораторная диагностика, 1994, №6, С. 23-26), и (Лабораторная медицина,1998, №1, С. 20-24).
Наше сообщение посвящено той же проблеме и основывается на многолетнем опыте региональной лаборатории гемостаза Алтайского гематологического центра. Цель - определиться с едиными подходами к методике выполнения и интерпретации результатов ПТ.
ПРОТРОМБИНОВЫЙ ТЕСТ
Принцип. Что из себя представляет в общих чертах протромбиновый тест. Методика его была предложена в 1935 году Армандом Квиком и соавт. и получила распространение как "время по Квику" или "тест по Квику". Как известно, ПТ симулирует в пробирке работу внешнего пути свертывания, в соответствии с чем при рекальцификации тромбопластин, выполняя роль тканевого фактора, активирует фактор VII. Затем, с участием факторов X и V, протромбин (фактор II) активируется в тромбин, коагулирующий фибриноген. Таким образом определяется время свертывания рекальцифицированной плазмы (или крови) при добавлении к ней тканевого тромбопластина определенной активности и чувствительности к дефициту факторов протромбинового комплекса(VII, X, V, II).
Реактивы
Тромбопластин. Согласно с международным требованиям этот реагент должен быть стандартизирован фирмой-изготовителем и иметь следующие характеристики:
1) Активность в протромбиновом тесте на контрольной нормальной плазме должна определяться в пределах от 11 до 14 секунд (в зависимости от техники определения - мануальной или на коагулометре), в среднем 12 с;
2) Препарат тромбопластина должен быть растворимым, т. е. приготавливаться (без растирания) простым разведением сухого реагента дистиллированной водой или раствором хлорида кальция (0,277%);
3) Тромбопластин должен иметь на маркировке или в спецификации международный индекс чувствительности (МИЧ или ISI). Последний характеризует степень чувствительность тромбопластина к дефициту факторов протромбинового комплекса (прежде всего фактора VII) и призван свести к минимуму разнородность результатов определений протромбинового времени при использовании разных тромбопластинов. Это особенно важно для правильного контроля за лечением непрямыми (оральными) антикоагулянтами. При таком контроле МИЧ используемого тромбопластина должен быть не выше 1,4. Основной перечень доступных в России коммерческих препаратов растворимого тромбопластина приведен в табл. (см. ниже).
Примечание: Следует отметить также, что использующийся во многих лабораториях нерастворимый (кадаверный) тромбопластин не калиброван по МИЧ, имеет низкую активность (16-19 с) и по многим параметрам не соответствует международным требованиям, предъявляемым к этому реагенту. Ослабленные тромбопластины (в большом разведении) могут использоваться при определении содержания фибриногена по методу Рутберг и волчаночного антикоагулянта.
В настоящее время стандартизированный растворимый тромбопластин (Техпластин-тест) производится фирмой "Технология-Стандарт". Индекс его чувствительности в разных сериях колеблется от 1,1 до 1,2, при активности 11-14 с. Для получения тромбопластин-кальциевой смеси во флакон перед работой вносят 5,0 мл дистиллированной воды. Один флакон реагента расчитан на 25 определений, время использования - до 7 суток, в зависимости от температурного режима его хранения.
Материал для исследования
Цитратная бедная тромбоцитами плазма.
Ход определения.
Предварительно, за 10 мин до начала исследования, разведенную (в соответствии с рекомендацией фирмы-изготовителя) тромбопластин-кальциевую смесь помещают на водяную баню при +37°С и оставляют там до окончания работы.
Определение протромбинового времени по Квику. Исследуемую плазму, в объеме 0,1 мл, прогревают в пробирке на водяной бане (или кювете коагулометра) при +37°С. Через 30 с (60 с в кювете коагулометра) добавляют 0,2 мл прогретой до +37°С тромбопластин-кальциевой смеси, включают секундомер и определяют время свертывания. Точно также определяют ПВ в контрольной нормальной плазме.
Вариант метода для капиллярной крови. После прокола кожи пальца скарификатором, первую каплю крови не используют, а последующие 0,09 мл крови немедленно смешивают в пробирке (или кювете коагулометра) с 0,01 мл 3,8% раствора цитрата натрия. У доношенных новорожденных 3-5 дней жизни в это количество цитрата добавляют 0,10-0,11 мл крови. Кровь и раствор цитрата тщательно смешивают. Затем к 0,1 мл стабилизированной крови добавляют 0,1 мл тромбопластин-кальциевой смеси. Температура смешиваемых компонентов должна быть +37°С. Регистрируют время свертывания.
Определение протромбинового времени в крови для обеспечения должной точности должно проводиться на коагулометре с механическим принципом регистрации результатов, например коагуляторе фирмы Behnk Electronik, Германия (Тромбостат-1 или Тромбостат-2).
Представление результатов теста
Результат учитывают в секундах и выражают по одному из следующих вариантов:
1. Указывают протромбиновое время (ПВ) в секундах с указанием контрольных значений, полученных при исследовании контрольной нормальной плазмы. Для мануального определения оптимальная активность реактива в норме соответствует 12-15 с, для коагулометров - 11-14 с.
2. В отечественной литературе в течение длительного времени использовался расчет протромбинового индекса (ПИ) по следующей формуле:
ПИ = (ПВ контрольной нормальной плазмы /ПВ больного) x 100%
Однако такая методика учета результатов устарела, не соответствует современным требованиям и маскирует активность используемого тромбопластина.
3. В настоящее время приняты следующие варианты оценки результатов протромбинового (тромбопластинового) теста:
Определяют протромбиновое отношение (ПО) в единицах по формуле:
ПО = (ПВ больного /ПВ контрольной нормальной плазмы)
Для различных тромбопластинов ПО в норме составляет 0,7-1,1.
Затем, для учета международного индекса чувствительности тромбопластина (МИЧ), возводят ПО степень МИЧ или ISI (указан в маркировке фирмой-изготовителем) и таким образом расчитывают
международное нормализованное отношение
(МНО или INR).
Например, протромбиновое время плазмы больного, получающего антикоагулянты - 45 с. Протромбиновое время контрольной нормальной плазмы - 12,7 с. МИЧ (или ISI), указанный в инструкции к тромбопластину - 1,08.
Отсюда МНО для данного больного = ПОМИЧ = (45 : 12,7)^1,08 = 3,92.
Нормальное МНО (у здоровых людей) меньше 1,3. При лечении непрямыми антикоагулянтами МНО поддерживают на уровне 2,0-3,5 в зависимости от клинической ситуации.
Таким образом, чем выше МНО, тем значительнее полученная гипокоагуляция и тем чаще и опаснее геморрагические осложнения. Вместе с тем, определение МНО, в сравнении с протромбиновым индексом, позволяет более точно подобрать дозу антикоагулянта и уменьшить риск кровотечений, связанных с его передозировкой.
4. В тех случаях, когда индекс чувствительности тромбопластина не приведен, нередко применяется расчет активности факторов протромбинового комплекса (в процентах) по Квику, с использованием калибровочной кривой, построенной по результатам измерения ПВ в разведениях контрольной нормальной плазмы (описание методики и калибровочная сетка приводятся в инструкциях к соотвествующим коммерческим наборам для определения ПВ).
Реагенты тромбопластинов
В настоящее время производятся большое количество различных тромбопластинов - мозговых человека, кролика, быка и др., плацентарных и др. Далеко не полный их перечень приведен ниже:
Перечень вариантов растворимого тромбопластина и источников его получения
Наименование тромбопластина | Фирма-изготовитель | Источник получения | МИЧ (ISI) |
Thromborel | Behring, Германия | Плацента человека | - |
Simplastin Exel | Organon Teknika, Голландия | Мозг кролика | 1,1-1,2 |
Simplastin Exel S | Organon Teknika, Голландия | - | 2,0 |
Neoplastin Plus | Roche, Франция | - | около 1,0 |
DiaPlastin | DiaMed, Швейцария | мозг кролика | 1,7-1,9 |
DiaPlastin-E | DiaMed, Швейцария | мозг кролика | около 1,0 |
Isimat 1 | BioMerieux, Франция | - | 1,0-1,1 |
Thromboplastin | Immuno, Австрия | мозг кролика | 1,2 - 1,9 |
Dia-Plastin | Dia-Med, Швейцария | мозг кролика | 1,0-1,1 |
Normotest, Thrombotest, Nycoplastin | Nycomed, Норвегия | мозг кролика, мозг быка, | - |
Техпластин | Технология-Стандарт, Россия | Мозг человека | 1,1-1,2 |
Медипластин | Медио+, Россия | мозг кролика | 1,2 |
Тромбопластин растворимый | Ренам, Россия | мозг кролика | 1,5 |
Примечание: МИЧ - международный индекс чувствительности, прочерк - нет данных.
Результаты теста
Необходимо учитывать, что результаты протромбинового теста могут искажаться наличием в крови волчаночного антикоагулянта и других ингибиторов свертывания, что нередко затрудняет контроль за эффектом применения кумаринов.
Какие результаты ПТ можно ожидать при обследовании больных?
Укорочение времени свертывания по ПТ встречается редко и не имеет самостоятельного диагностического значения за исключением, скажем, контроля за лечением ингибиторной формы гемофилии концентратом активированного фактора VII. Иногда укорочение ПТ на 1-3 секунды отражает, вместе с укорочением АЧТВ, гиперкоагуляционный сдвиг коагулограммы.
Более клинически значимо и чаще всего встречается удлинение ПТ. Ниже приводятся четыре основных причины такого удлинения:
1. самое частое - связанно с уменьшенным синтезом факторов протромбинового комплекса при системном нарушении белок-синтетической функции печени (идет наравне с со снижением фракции альбуминов в сыворотке крови). Эта ситуация в основном встречается при патологии печени - при гепатитах и циррозах.
2. другая причина обусловлена искажением синтеза факторов протромбинового комплекса в гепатоцитах в связи с приемом антагонистов витамина К (непрямых антикоагулянтов). При этом производство факторов свертывания идет в нормальном режиме, но их они недееспособны из-за отсутствия реакции их карбоксилирования. Такие нефункциональные факторы свертывания обозначают как "PIVKA". Интересно, что схожая картина может быть при обтурационной форме желтухи, когда нарушается отток желчи и в 12-перстной кишке нарушается всасывание жирорастворимого витамина К - провоцируется ситуация, похожая на прием, например, фенилина. Здесь удлинение в ПТ наступает быстро, на 2-3 день после обтурации, и носит выраженный характер (в отличие от других форм желтухи).
3. третья причина - интенсивное потребление факторов свертывания при внутрисосудистом свертывании крови, ДВС-синдроме. Надо сказать, что гипокоагуляция по ПТ здесь может усугубляться гепарином и кровезаменителями, такими, как реополиглюкин и гемодез, а также продуктами фибринолиза (ПДФ), поэтому нельзя гипокоагуляцию в 3 фазе ДВС связывать лишь с потреблением факторов свертывания.
4. последняя, редкая, но важная причина - диагностика врожденного изолированного дефицита одного из факторов протромбинового комплекса (VII, X, V или II).
