ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ……………………………………….
ВВЕДЕНИЕ……………………………………………………….
ГЛАВА І. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ………………………………………
І.1. Общая характеристика строения и функций соединительной
ткани……………………………………………………………….
І.2. Строение и свойства конструкционных биополимеров
соединительной ткани…………………………………………..
І 2.1. Общая характеристика коллагеновых белков…………….
І.2.2. Аминокислотный состав, первичная структура и
молекулярная конформация фибриллярных коллагенов……….
І 2.3. Синтез и внутриклеточный процессинг коллагена……….
І 2.4. Фолдинг и внеклеточный процессинг коллагена………….
І.2.5. Общая характеристика эластина…………………………….
І.2.6. Аминокислотный состав, первичная структура и
молекулярная конформация эластина…………………………….
І.2.7. Общая характеристика, синтез и строение гликозаминогликанов…
І.3. Строение и свойства надмолекулярных комплексов
конструкционных биополимеров..……….......................................
І.3.1. Коллагеновые и эластиновые волокна………………………
І.3.2. Протеогликаны………………………………………………..
І.4. Строение и биомеханические свойства сухожилий, кожи и
аорты……………………………………………………………….
І.4.1. Межклеточный матрикс ………………………......................
І.4.2. Основное вещество…………………………………………...
І.4.3. Структурно-метаболическая характеристика тканей……..
І.4.4. Вязко-упругие свойства сухожилий, кожи и аорты………..
І.4.5. Денатурационные переходы в коллагеновых структурах……
І.5. Возрастные изменения компонентного состава конструкционных
биополимеров, структурной стабильности и вязко-упругих
свойств тканей………………………………… І.5.1. Возрастные изменения компонентного состава конструкционных
биополимеров в тканях………………………...
І.5.2. Возрастные изменения структурной стабильности тканей………..
І.5.3. Возрастные изменения вязко-упругих свойств тканей…………..
І.6. Роль фибробластов в возрастных изменениях соединительной
ткани…………………………………………………………………..
ГЛАВА ІІ. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ..........
ІІ.1. Экспериментальные животные и исследованные ткани………….
ІІ.2. Исследование синтеза коллагена типа I, эластина и
гликозаминогликанов в тканях крыс in vitro……………
ІІ.2.1. Инкубация образцов кожи и аорты………………………….
ІІ.2.2. Радиоизотопное исследование синтеза коллагена типа I и
эластина……………………………
ІІ.2.3. Радиоизотопное исследование синтеза гликозаминогликанов…
ІІ.3. Выделение коллагена типа I, эластина и гликозаминогликанов
из тканей крыс………………………………
ІІ. 3.1. Приготовление образцов тканей для выделения коллагена,
эластина и гликозаминогликанов ……………………...
ІІ.3.2. Экстракция коллагена типа I………………………………….
ІІ.3.3. Диализ коллагенсодержащих экстрактов…………………….
ІІ.3.4. Экстракция эластина…………………………………………..
ІІ.3.5. Экстракция гликозаминогликанов……………………………
ІІ.3.6. Фракционирование гликозаминогликанов…………………..
ІІ.4. Аналитическое определение концентрации коллагена типа I,
эластина и гликозаминогликанов в тканях крыс…………..
ІІ.4.1. Аналитическое определение гидроксипролина……………..
ІІ.4.2. Карбазоловая реакция на D-глюкуроновую кислоту………..
ІІ.4.3. Орциновая реакция на L-идуроновую кислоту………………
ІІ.5. Изучение некоторых стадий процессинга в коллагене
типа I из тканей крыс…………………………...................................... ІІ.5.1. Радиоизотопное определение степени гидроксилирования
остатков пролина………………………………….....
ІІ.5.2. Аналитическое определение свободных е-NH2 - групп
лизина и гидроксилизина…………………………
ІІ.5.3. Аналитическое определение свободных альдегидных групп
аллизина и гидроксиаллизина……………………………….............
ІІ.6. Исследование физико-химических свойств надмолекулярных
комплексов в тканях крыс in vitrо……………….
ІІ.6.1. Исследование вязко-упругих свойств…………………..................
ІІ.6.2. Исследование термостабильности ………………………………
ІІ.6.3. Электрофоретическое исследование поперечного связывания
коллагена………………………………………………
ІІ.6.4. Флуориметрическое исследование содержания шиффовых
оснований в коллагене………………
ІІ.7. Исследование коллагеновых фибрилл и волокон in vitro
и in vivo………………………………………………
ІІ.7.1. Исследование самосборки коллагеновых фибрилл in vitro….
ІІ.7.2. Гистологическое исследование коллагеновых волокон в
коже in vivo……………………………………………………
ІІ.7.3. Поляризационно-оптическое исследование коллагеновых
волокон хвостовых сухожилий…………………………………
ІІ.8. Исследование синтеза коллагена и гликозаминогликанов
в монослое культуры фибробластов……………
ІІ.8.1. Клонирование клеток и подсчёт их числа……….
ІІ.8.2. Определение содержания коллагена и гиалуроновой
кислоты в монослое…………………………………………….
ІІ.9. Математическая обработка полученных результатов…….
ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ…
III.1. Возрастные особенности вязко-упругих свойств тканей…
III.1.1. Механические свойства………………………………………
III.1.2. Энергия деформации……………………………………………..
III.2. Возрастные особенности обмена и содержания
конструкционных биополимеров в коже, ……………………….
III.2.1 Обмен коллагена, эластина и гликозаминогликанов……………..
III.2.2. Содержание коллагена, эластина и гликозаминогликанов……..
III.2.3. Связь между содержанием конструкционных
биополимеров в коже и её вязко-упругими свойствами …………..
III.3. Возрастные особенности структурной стабильности
надмолекулярных комплексов кожи………………..
III.3.1. Кинетика и энергия разрушения коллагеновых структур………
III.3.2. Субъединичный состав и степень полимеризации
денатурированного коллагена…………………………………….
III.4. Возрастные особенности процессинга и поперечного
связывания коллагена……………………………………………..
III.4.1. Гидроксилирование пролила ……………………………………..
III.4.2. Окислительное дезаминирование е-аминогрупп лизила и
гидроксилизила и содержание шиффовых оснований………….
III.4.3. Молекулярные механизмы и биологический смысл инверсии
структурной стабильности надмолекулярных комплексов
соединительной ткани в раннем постнатальном онтогенезе…….
III.5. Возрастные особенности формирования коллагеновых
волокон и фибрилл in vivo и in vitro ………………………
III.5.1. Временные изменения размеров фибрилл, образующихся из
коллагена типа I in vitro………………………………….
III.5.2. Возрастные изменения размеров коллагеновых волокон
в коже in vivo………………………………………………
III.6. Особенности синтеза коллагена и гликозаминогликанов
фибробластами в зависимости от стадии роста и числа
клеточных делений…………………………………………….
III.6.1. Содержание коллагена и гликозаминогликанов в монослое в
зависимости от стадии роста фибробластов………………….
III.6.2. Содержание коллагена и гликозаминогликанов в монослое
фибробластов в зависимости от числа клеточных делений…….
ЗАКЛЮЧЕНИЕ……………………………………………………………
ВЫВОДЫ…………………………………………………………………
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ………………………
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ
ГАГ – гликозаминогликан
ДАБА – n-диметиламинобензальдегидом
ДДС Na – додецилсульфата натрия
ДНФ – динитрофторбензол-производных
ДНФГ – 2,4-динитрофторбензола
СОН– групп - альдегидная группа
E – модуля Юнга в области упругой деформации
G – глицин
∆G – свободная энергия Гиббса
-G-X-Y – повторяющиеся триплет амино кислоты
Hуpro – гидроксипролин
3H-Pro – радиоактивный пролин
3H-Hypro – радиоактивный гидроксипролин
КРС – крупно-рогатый скота
Pro – пролин
Р – предельная нагрузка в момент разрыва
R – универсальная газовая постоянная
S – площадь поперечного сечения образца
Т – абсолютная температура в градусах Кельвина
X – пролин или другая аминокислота
Y – гидроксипролин или другая аминокислота
ч – чистый
ч. д.а – чистый для анализов
хч – химический чистый
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы. Соединительная ткань играет существенную, а часто и определяющую роль в морфогенезе, развитии и старении органов и организма в целом. Её специфической особенностью является наличие в ней сильно развитого и высокоорганизованного межклеточного матрикса. Именно конструкционные биополимеры матрикса - коллаген, эластин и гликозаминогликаны определяют физико-химические, функциональные свойства соединительной ткани.
В большом числе работ показано, что в онтогенезе все без исключения разновидности соединительной ткани становятся более прочными и жёсткими, а структурная стабильность надмолекулярных комплексов матрикса с возрастом повышается. Эти изменения рассматриваются как адаптация, необходимая, на большей части онтогенеза, для сохранения соответствия между функциональными, в первую очередь, механическими, свойствами соединительной ткани и требованиями, которые предъявляются ей в процессе роста массы и физической силы организма [32, 53].
В основе таких изменений функциональных свойств соединительной ткани должны лежать, в первую очередь, структурные перестройки матрикса, заключающиеся как в изменении компонентного состава матрикса, так и в возможных изменениях свойств молекул конструкционных биополимеров.
Естественно, что эти структурные перестройки должны зависеть от онтогенетических особенностей клеточного метаболизма, которые являются частью общей программы возрастного развития организма. Клетки соединительной ткани, изменяя интенсивности синтеза и распада конструкционных биополимеров и специфических ферментов процессинга, которые задают конечную структуру молекул, определяют возрастные особенности состава матрикса и степени его развития [156, 162, , 195].
В настоящее время, однако, работ, посвящённых изменению в онтогенезе структуры индивидуальных молекул биополимеров матрикса, его перестройкам на надмолекулярном уровне, связи этих перестроек с клеточным метаболизмом и, как следствие этого, изменениям функциональных свойств соединительной ткани, практически не существует.
Не известны причины и биологический смысл инверсии возрастного повышения структурной стабильности матрикса в раннем постнатальном онтогенезе.
Не изучены особенности связи между возрастными изменениями метаболизма конструкционных биополимеров в ткани и изменениями их метаболизма в индивидуальных клетках соединительной ткани, прошедших разное число делений.
Учитывая сказанное, целесообразным является более глубокое изучение причинно-следственных связей между возрастными изменениями интенсивности синтеза и распада коллагена, эластина и гликозаминогликанов, их концентраций, уровнем внутри - и внеклеточного процессинга коллагена, функциональными особенностями его молекул, строением матрикса и физико-химическими свойствами соединительной ткани.
Важным является и изучение синтеза коллагена и гликозаминогликанов фибробластами в зависимости от числа их делений.
Эти исследования актуальны для понимания неизвестных ещё особенностей морфогенеза органов, возрастных изменений их функциональных свойств, общих и частных причин заболеваний соединительной ткани и могут быть полезны для поисков новых молекулярных методов их коррекции.
Связь работы с научными программами, планами, темами. Работа выполнена в соответствии с планами научно-исследовательских работ Харьковского национального университета имени в рамках госбюджетных тем «Фізіолого-біохімічні та структурно-функціональні закономірності клітинної адаптації до дії екзо - та ендогенних чинників» (№ держреєстрації 0106U001584) и «Механізми впливу фізичних факторів і біологічно-активних речовин на метаболізм та функціональні властивості клітин сполучної тканини» (№ держреєстрації 0109U005083)
Цель и задачи исследования. Цель работы – выявить особенности связи в постнатальном онтогенезе крыс между: обменом коллагена типа І, эластина и ГАГ в коже, аорте и хвостовых сухожилиях и функциональными свойствами этих тканей (вязко-упругость, структурная стабильность), процессингом коллагена типа І и характером его фибриллообразования, а также зависимость накопления коллагена и ГАГ в культуре фибробластов от её возраста
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
Изучить in vitro вязко-упругие свойства (прочность, модуль Юнга, предельную деформацию) кожи, аорты и хвостовых сухожилий крыс 1, 3, 12 и 24 месяцев Изучить in vitro термостабильность надмолекулярных коллагеновых структур (кинетику разрушения и свободную энергию Гиббса) в коже крыс 1, 3, 12 и 24 месяцев Изучить in vitro интенсивность синтеза, распада и концентрацию коллагена, эластина и ГАГ в коже крыс 1, 3, 12 и 24 месяцев Изучить in vitro степень гидроксилирования пролила и окислительного дезаминирования лизила и гидроксилизила и содержания шиффовых оснований в коллагене типа І из кожи крыс 1, 3, 12 и 24 месяцев. Изучить параметры коллагеновых фибрилл (распределение по длинам и диаметрам), образующихся in vitro из коллагена типа І крыс 1, 3, 12 и 24 месяцев, и сравнить их с параметрами коллагеновых волокон кожи у животных этих же возрастов in vivo. Изучить зависимость накопления коллагена и ГАГ в культуре фибробластов от числа клеточных делений в ней.Объект исследования - Молекулярные и клеточные механизмы связи между метаболизмом структурных биополимеров соединительной ткани и её функциональными свойствами в постнатальном онтогенезе.
Предмет исследования – синтез, распад и содержание коллагена типа І, эластина, ГАГ в соединительной ткани, её вязко-упругие свойства и термостабильность, процессинг и фибриллообразование коллагена, синтез коллагена и ГАГ фибробластами.
Методы исследования – радиоизотопный анализ (оценка интенсивности синтеза и распада коллагена, эластина и ГАГ, гидроксилирования пролила), аналитическое определение альдегидных и
е-аминогрупп в коллагене, флуориметрия (оценка активности внутриклеточных и внеклеточных стадий его процесснга), ионообменная хроматография (оценка содержания ГАГ), механические измерения вязко-упругих свойств тканей, измерения кинетики и энергетики их гидротермического сокращения, культивирование фибробластов, методы статистического анализа.
Научная новизна полученных результатов. Впервые проведена количественная оценка связи между возрастными особенностями синтеза, распада и содержания коллагена, эластина и гликозаминогликанов, а также процессинга коллагена в коже, аорте и хвостовых сухожилиях, как модели неминерализованной соединительной ткани, и их функциональными свойствами – вязкоупругостью, структурной стабильностью и удельным вкладом энергий вязкого течения и гуковской упругости в деформируемой ткани. Показано, что инверсия направленности возрастных изменений этих свойств в раннем постнатальном онтогенезе определяется изменением соотношения интенсивностей синтеза этих биополимеров, которое происходит на фоне повышения интенсивности распада каждого из них, а также преимущественным развитием в коллагене внутримолекулярных сшивок. Биологический смысл этого явления заключается в том, что в этот период происходит интенсивный рост организма и межклеточные комплексы с высокой структурной стабильностью и жёсткостью неблагоприятны для клеточной дифференцировки, перемещения клеток и успешного морфогенеза. Впервые продемонстрировано, что возрастные изменения фибриллогенеза и размеров коллагеновых волокон в ткани определяются изменениями интенсивности окислительного дезаминирования лизила и гидроксилизила на стадии внутриклеточного и образования межмолекулярных сшивок типа шиффовых оснований на стадии внеклеточного процессинга. Впервые установлено, что в основе возрастного уменьшения накопления конструкционных биополимеров в ткани является снижение интенсивности их синтеза фибробластами с ростом числа клеточных делений.
Практическое значение полученных результатов. Полученные результаты позволяют углубить современные представления о молекулярных и клеточных механизмах морфогенеза органов, развитии и возрастных изменениях свойств их соединительной ткани в норме и патологии.
Выявленные особенности действия этих механизмов на разных этапах постнатального онтогенеза могут быть использованы в педиатрии, геронтологии, спортивной медицине, хирургии, ортопедии, при лечении болезней соединительной ткани.
Отдельные положения работы методы исследования используются в учебном процессе в спецкурсах «Структура и функции белков», «Медицинская биохимия» и лабораторно-практических занятиях «Методы исследования углеводов» на кафедре биохимии Харьковского национального университета имени .
Личный вклад соискателя. Выбор темы диссертационной работы, постановка цели и задач, выбор объектов и методов исследования, обсуждение полученных экспериментальных результатов и формулировка выводов были проведены совместно с научным руководителем.
Автор самостоятельно обработал специальную литературу по теме диссертации, выполнил экспериментальные исследования, принял активное участие в написании и подготовке к публикации всех статей и тезисов по теме диссертационной работы и провёл математическую обработку полученных результатов. Гистологические исследования были проведены совместно с профессором Г. І. Губиной-Вакулик (Харьковский государственный медицинский университет), а культивирование фибробластов - с к. б.н. (НИЧ Харьковского национального университета им. ), что отражено в совместных публикациях. В диссертации не использованы идеи или разработки, принадлежащие соавтором опубликованных научных работ.
Апробация результатов диссертации. Основные положения работы были представлены и обсуждены на: II Международной научной конференции студентов и аспирантов «Молодь та поступ біології», Львов, 2007; ІІ Международной конференции молодых учёных «Біологія: від молекули до біосфери», Харків, 2007; Всеукраинской научной конференции «Актуальные проблемы современной биохимии и клеточной биологии», Днепропетровск, 2008; VIII Международном симпозиуме «Биологические механизмы старения, 2008; IV Международной конференции молодых учёных «Біологія: від молекули до біосфери», Харьков, 2009; ІV Международной научной конференции студентов и аспирантов «Молодь та поступ біології», Львов, 2009; IX Международном симпозиуме «Биологические механизмы старения, 2010; XVIII съезде Украинского физиологического товарищества, Одесса, 2010; Х Украинском биохимическом съезде, Одесса, 2010; V Международной конференции молодых учёных «Біологія: від молекули до біосфери», Харьков, 2010.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 17 работ, которые полностью отражают основное содержание диссертации, в том числе 4 статей в специализированных научных журналах и 13 - в материалах и тезисах съездов, конференций, симпозиумов.
