оронкина, каченко, равдин
Саратовский национальный исследовательский государственный университет им.
E-mail: *****@***ru
При разработке новых медицинских препаратов существует потребность проанализировать взаимодействие исследуемого препарата с различными клеточными структурами. Один из наиболее простых способов решения данной задачи – использование современных микроскопических методов, одним из которых является атомно-силовая микроскопия, позволяющая получить детальное изображение образца с очень высоким разрешением. Данный метод очень удобен для исследования клеток крови, однако, большинство современных работ описывает работу с мазками крови, что вызывает определенные затруднения при работе с модельной средой [1,2]. В таком случае удобнее работать с клетками крови, нанесенными из суспендированного раствора, что требует разработку дополнительного метода подготовки исследуемого образца, так как описываемые в современных научных работах методы не всегда представляют собой удобные для реализации решения[3,4].
В настоящей работе представлена методика создания образца клеток крови из суспендированного раствора для исследования их на атомно-силовом микроскопе, кроме того, показана применимость данной методики при исследовании клеток с нанесенным красителем (наночастицы – фотосенсибилизатор), а также клеток в растворе растительного антиоксиданта Gratiola officinalis (L).
Эксперименты проводились на крови белых лабораторных крыс согласно “Общим принципам экспериментов на животных”, которые соответствуют положениям Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей. В экспериментах использовалась 0.005% суспензия эритроцитов в растворе Рингера, гидрофилизированными наночастицами Астраленами (0.03мг/мл), а также антиоксидантом.
Для предотвращения высыхания эритроцитов при осаждении их на стекло использовалась чашка Петри, наполненная парами раствора Рингера. После насыщения камеры парами на стекло наносилась капля 0,005% суспензии эритроцитов, после чего клетки крови осаждались в течение 30 минут на водяной бане при 45°С, после этого не осевшие на стекло эритроциты трижды смывались раствором Рингера с получением разреженного монослоя.
Далее, в той же наполненной парами чашке Петри проводилась фиксация монослоя 1% глутаровым альдегидом. На монослой эритроцитов наносилась капля фиксатора и выдерживалась при комнатной температуре в течение 30 минут. После этого стекло трижды отмывалось дистиллированной водой для удаления кристаллизовавшихся из раствора Рингера солей и для смывания излишков глутарового альдегида. После этого готовый образец фиксировался на сапфировой подложке с помощью двухстороннего скотча.
Сканирование образцов проводилось на атомно-силовом микроскопе Solver P47 (NT-MDT) в контактном режиме. Использовался зондовый датчик CSG10, скорость сканирования: 1-1,7 Гц, область сканирования: 43Ч43µм.
Сканирование для получения изображения с высоким разрешением занимает длительное время, но при данной методике подготавливания образцов исследуемые клетки остаются не разрушенными и не меняющими свою исходную морфологию достаточно долгое время, чего невозможно достичь при создании образца клеток методом мазка (Рис. 1). Кроме того, данная методика применима при исследовании образцов клеток, полученных из многокомпонентных суспензий, таких как клетки с нанесенными на них наночастицами или клетки в растворе антиоксидантов.
|
Рис.1 АСМ-изображение эритроцита при сканировании в контактном режиме |
Библиографический список
1. , , . Атомно-силовая микроскопия эритроцитов. БелСЗМ-6, г. Минск, 2004 г., С. 97-101.
2. , , . АСМ-исследование клеток сердечно-сосудистой системы и крови. Проблемы и надежды. БелСЗМ-4, г. Гомель, 2000 г., С. 44-47.
3. Применение атомно-силового микроскопа в медико-биологических исследованиях: Приложение к руководству пользователя атомно-силового микроскопа NT-206 – Гомель: ОДО “Микротестмашины”, 2013. – 42 с.
4. , . Влияние способа подготовки образца на морфофункциональные характеристики эритроцитов при исследовании методом атомно-силовой микроскопии. Вестн. Ом. ун-та. 2013. № 2. С. 129–132.
Вид доклада: (устный)/ стендовый
