Потенцирование аммиаком летального действия этанола на крыс
, ,
Военно-медицинская академия, Санкт-Петербург (научный руководитель –
)
_________________________________________________________________________________
Внутрижелудочное введение крысам 16,57 М раствора этанола (446 ммоль/кг ≈ 1,4 ЛД50/48 час) приводило к повышению через 3 ч концентрации аммиака в крови воротной вены – в 1,4 раза, нижней полой вены каудальнее впадения в неё почечных вен – в 2,2 раза и краниальнее впадения в неё печёночных вен - в 2,5 раза; в смешанной крови, полученной при декапитации – на 39% Накопление аммиака в лаважном растворе, введённом внутрибрюшинно, ускорялось втрое. После введения этанола трёхчасовое пребывание животных в атмосфере, содержащей аммиак (0,84–1,07 мг/л, т. е. ≈ 1/8 ЛК50 для интактных крыс), вызывало повышение уровня аммиака в крови в 2,4 раза в сравнении с изолированным действием этанола. Ингаляция аммиака потенцировала летальное действие этанола (ФИД = 0,81), угнетала внешнее дыхание и потребление кислорода организмом. Сделан вывод о неблагоприятном влиянии наблюдавшихся изменений кинетики эндогенного аммиака на исход острой алкогольной интоксикации у крыс.
Ключевые слова: этанол; крысы; эндогенный аммиак; атмосферный аммиак; гипераммониемия; летальность
В числе проявлений цитотоксичности этанола - нарушение аммиак-обезвреживающей функции печени. Синтез мочевины тормозился у людей при алкогольной интоксикации лёгкой степени [4] и у крыс при 5-дневной замене питьевой воды раствором этанола [5]. Пятидневное введение крысам этанола сопровождалось повышением концентрации аммиака в крови [8]. В аналогичных условиях в слизистой оболочке тонкой кишки крыс отмечены метаболические изменения, могущие вести к ослаблению её барьерной функции в отношении аммиака [9]. При одновременном нарушении его обезвреживания в печени это может создать предпосылки для интенсификации поступления аммиака кишечного происхождения в общий кровоток. Возникает вопрос о роли эндогенного аммиака в патогенезе острой алкогольной интоксикации. Одним из подходов к его решению может быть оценка влияния гипераммониемии, вызываемой введением аммиака в организм извне, на эффекты этанола. В рамках настоящей работы исследовалось влияние ингаляционного введения аммиака в нелетальной токсодозе на формирование летального исхода алкогольной комы у крыс.
Методика исследования
Самцов беспородных белых крыс массой 180-220 г, приобретённых в питомнике “Рапполово” АМН РФ, распределили в 2 группы (интактную и подвергаемую действию этанола). Моделью комы считали утрату животными всех сенсомоторных рефлексов, исключая роговичный. Этанол вводили в дозе 446 ммоль/кг (в/ж), вызывавшей гибель 17% животных за 3 ч. Данная доза была минимальной из вызывавших развитие комы у всех животных в течение 3 ч после введения этанола. Для обеспечения указанной дозы этанола его вводили в виде 16,57 М раствора в объёме 26 мл/кг. Контрольные животные получали воду в таком же объёме. Для беспрепятственного поступления этанола в кишечник, в течение суток перед экспериментом животных не кормили при неограниченном доступе к воде.
В 1-й серии опытов изучали действие этанола на концентрацию аммиака в крови из бассейнов воротной и нижней полой вены. Численность крыс, выживших к 3 часу опыта, составила 12 в каждой группе. Через 3 ч пунктировали v. cava inf. в двух местах – каудальнее впадения в неё v. v.renales и краниальнее v. v.hepaticae - и v. portae. При каждой пункции отбирали 1 мл крови в гепаринизированные шприцы, депротеинировали трихлоруксусной кислотой и определяли концентрацию аммиака спектрофотометрически с реактивом Несслера [6]. Во избежание травматического стресса крысам интактной группы вводили тиопентал натрия (75 мг/кг), забор проб начинали через 1-2 минуты, в момент перехода животных в боковое положение. По данным, полученным нами ранее [7], тиопентал в этой дозе существенно не изменял уровень аммиака в крови крыс ранее, чем через 30 мин после введения.
Во 2-й серии опытов оценивали накопление аммиака в 0,9% растворе хлорида натрия, введённом внутрибрюшинно (50 мл/кг) через 2,5 ч после в/ж введения этанола. Через 3 ч после введения этанола (0,5 ч после введения лаважного раствора) проводили лапаротомию, лаважный раствор количественно собирали и в его центрифугате определяли аммиак. Численность каждой группы составила 7 крыс. Во избежание травматического стресса, за 30-40с до проведения лапаротомии животных интактной группы оглушали парами хлороформа, что, по данным литературы [10], не изменяет уровень аммиака в крови в эти сроки.
В 3-й серии опытов после введения этанола животных оставляли в атмосфере чистого воздуха либо помещали на 3 ч в атмосферу, содержавшую аммиак (1,07 мг/л в начале и 0,84 мг/л в конце 3-часового интервала, что составляло, приблизительно, 1/8 ЛК50 [1]). Методика ингаляционного воздействия аммиака описана нами ранее [2]. Этанол вводили в дозах 240, 275, 309, 378, 446, 515 или 583 ммоль/кг; для каждой из этих доз численность животных в каждой группе составила 6 (при дозе 446 ммоль/кг – 18). Животных наблюдали в течение 2 суток – максимального срока, в который отмечались летальные исходы. Регистрировали летальность за 3 ч и за 48 ч, рассчитывали среднюю продолжительность жизни (СПЖ) павших животных. Часть крыс, получивших этанол в дозе 446 ммоль/кг (≈ 1,4 ЛД50/48 час), а также интактных животных, использовали для определения показателей газообмена и концентрации аммиака в крови. Потребление кислорода организмом (QO2) определяли до и через 3 ч после введения этанола, как описано ранее [3]; одновременно подсчитывали частоту дыхательных движений (ЧДД). Выживших к 3 ч крыс декапитировали, в полученной из туловища крови определяли концентрацию аммиака.
Значимость межгрупповых различий средних величин определяли с помощью t-критерия Стьюдента. Параметры зависимости «доза этанола – эффект» определяли с помощью программы «Статистика + 2005», графическую обработку данных осуществляли с помощью программы «Origin 7.0»; рассчитывали фактор изменения дозы (ФИД = ЛД50 опыт/ЛД50 контроль).
Результаты исследования
При вскрытии животных через 3 ч после введения этанола были видны бесцветная жидкость и газ, наполнявшие желудок и тонкую кишку; отмечалась инъекция сосудов бассейна воротной вены. Уровень аммиака в крови из v. portae, v. cava inf. каудальнее v. v.renales и краниальнее v. v. hepaticae был выше, чем у интактных крыс, в 1,4, 2,2 и 2,5 раз, соответственно. Трансгепатический градиент концентрации аммиака в крови на фоне алкогольной интоксикации отсутствовал (табл.1). Втрое ускорялось накопление аммиака в лаважном растворе, введённом внутрибрюшинно (табл.2).
Гипераммониемия отмечена и при исследовании смешанной крови, полученной при декапитации (161 ± 19 мкМ против 98 ± 11 мкМ у интактных крыс, M ± m, n = 11, р ≤ 0,05). Ингаляция аммиака вела к дальнейшему повышению его уровня в крови - в 2,4 раза в сравнении с животными, подвергнутыми изолированному действию этанола (до 383 ± 95 мкМ, M ± m, n = 11, р ≤ 0,05). Алкогольная кома сопровождалась снижением ЧДД на 17% и QO2 – в 2,5 раза в сравнении с интактными животными. Ингаляция аммиака вызывала дальнейшее снижение показателей газообмена на 31 и 44%, соответственно (табл.3). При этом летальный эффект этанола потенцировался. Величина ЛД50/3ч этанола в контрольной группе составила 536 ммоль/кг (доверительный интервал 481–591ммоль/кг), а на фоне ингаляции аммиака – 432 ммоль/кг (391-473); ФИД = 0,81. В виде тенденции этот эффект сохранялся и после окончания ингаляции аммиака: величины ЛД50/48ч составили 322 (285–360) и 284 (247–322) ммоль/кг, ФИД = 0,88. СПЖ погибших животных на фоне ингаляции аммиака имела тенденцию к снижению при всех дозах этанола; при дозе 446 ммоль/кг эта тенденция была значимой (14,0 ± 2,2 ч против 20,1 ± 1,8 ч в контроле, M ± m, n = 17, p ≤ 0,05).
Таким образом, внутрижелудочное введение этанола в дозе, моделировавшей кому, сопровождалось у крыс гипераммониемией, обусловленной интенсификацией поступления в общий кровоток аммиака кишечного происхождения. Этот эффект зависел от интенсификации трансперитонеальной диффузии аммиака в бассейн нижней полой вены, в обход печени. Дальнейшее повышение уровня аммиака в крови путём его ингаляционного введения в токсодозе, нелетальной для интактных животных, усугубляло расстройства газообмена и потенцировало летальный эффект этанола. Полученные данные свидетельствуют о неблагоприятном влиянии наблюдавшихся изменений кинетики эндогенного аммиака на исход острой алкогольной интоксикации у крыс.
Таблица 1
Концентрация аммиака в крови воротной и нижней полой вены крыс через 3 ч после внутрижелудочного введения этанола в дозе 446 ммоль/кг (M ± m, n = 12)
Экспериментальная группа | Концентрация аммиака, мкМ | ||
v. portae | v. cava inferior каудальнее v. v.renales | v. cava inferior краниальнее v. v. hepaticae | |
Интактные | 168 ± 16 | 141 ± 17 | 110 ± 6† |
Этанол | 238 ± 20* | 304 ± 21 **† | 276 ± 17** |
Значимое различие с: интактными, * р ≤ 0,05; ** р ≤ 0,001;
показателем для v. portae, † р ≤ 0,01
Таблица 2
Накопление аммиака в лаважном растворе, введённом внутрибрюшинно крысам, при острой интоксикации этанолом (М ± m, n = 7)
Эксперимен-тальная группа | Объём неабсорбированного раствора в брюшной полости, мл/кг | Концентрация аммиака в лаважном растворе, мкМ | Скорость накопления аммиака в лаважном растворе, мкмоль/(кг•мин) |
Интактные | 31,6 ± 2,7 | 190 ± 40 | 0,21 ±0,06 |
Этанол | 32,8 ± 2,7 | 577 ± 61** | 0,68 ± 0,12* |
Значимое различие с интактной группой: * р ≤ 0,05; **р ≤ 0,01
Таблица 3
Частота дыхательных движений и потребление кислорода организмом у крыс через 3 ч после внутрижелудочного введения этанола в дозе 446 ммоль/кг и последующего ингаляционного воздействия аммиака (M ± m, n = 10)
Экспериментальная группа | Частота дыхательных движений, мин.-1 | Потребление кислорода, ммоль/(кг • мин.) | ||
Исходная | Через 3 ч | Исходное | Через 3 ч | |
Интактные | 110 ± 17 | 102 ± 16 | 1,19 ± 0,06 | 1,08 ± 0,07 |
Этанол | 117 ± 6 | 85 ± 7* | 0,98 ± 0,07 | 0,43 ± 0,05** |
Этанол + ингаляция аммиака | 129 ± 6 | 59 ± 9*† | 0,93 ± 0,11 | 0,24 ± 0,04**†† |
Значимое различие с: исходным уровнем * р ≤ 0,01; ** р ≤ 0,001;
изолированным действием этанола †р ≤ 0,05; ††р ≤ 0,001
Литература
Вредные вещества в промышленности, т.3. – 7-е изд. / Под ред. и . – Л.: Химия, 1977. – с.89. , , // Бюл. эксп. биол. мед. 2007. Т. 143, № 6. 634-637. , , // Бюл. эксп. биол. мед. 2003. Т.135, №4. С.419-422. Aagaard N. K., Thogersen T., Grofte T., Greisen J., Vilstrup H // Alcohol Clin. Exp. Res. 2004. Vol. 28, № 5. P. 697-701. Adachia K., Matsuhashia T., Nishizawaa Yu., Usukuraa J., Popinigisb J., Wakabayashia T. // Biochem. Pharmacol., 1995. Vol. 50, № 9. P. 1391-1399. Barrett JF. // Biochem J. 1935. Vol.29, №11. 2442-2445. Ivnitsky Ju. Ju., Rejniuk V. L., Schдfer T. V., Malakhovsky V. N. // Toxicol. 2006. Vol. 224. P.184-190. Mohanachari V., Reddy K. S., Indira K. // Toxicol. Lett. 1984. Vol. 20, № 2. P.225-228. VemuriM. C., Indira K. // Biochem. Med. Metab. Biol. 1986. Vol. 36, №1. P.8-13. Watanabe A., Kuwabara Y. // Res. Exp. Med. (Berl) 1994. Vol. 194, № 3. P. 157-164.Собственноручные подписи авторов:
(Владимир Леонидович Рейнюк)
(Тимур Васильевич Шефер)
Профессор (Юрий Юрьевич Ивницкий)
Реквизиты автора, осуществляющего связь с редакцией:
, Ленинградская обл., г. Тосно, пр. Ленина, дом 75, кв.130.
Телефоны: 8-261-373-98, 8-911-917-17-76
Электронная почта: *****@***ru
Реферат
P romotion of ethanol lethal action by ammonia in rats
Vladimir L. Rejniuk, Timur V. Schдfer, Jury Ju. Ivnitsky
Military Toxicology and Medical Protection, Military Medical Academy, 6, ul. Lebedeva,
St. Petersburg, 194044 Russia
To investigate effects of an increased ammonia delivery upon the lethal action of ethanol the exposure of rats to atmospheric ammoniac has been employed. At 3 h after the intragastral administration of 16.57 M ethanol solution (446 mmol/kg ≈ 1,4 DL50/48 h) the blood ammonia concentration in v. portae increased 1.4 times, in v. cava inf. caudally of v. v. renales inflow - 2.2 times, cranially of v. v. hepaticae – 2.5 times, and in mixed blood obtained by decapitation – by 64%. The rate of ammonia accumulation in lavage medium injected intraperitoneally at 2.5 h after the administration of ethanol was triple as that in intact rats. The exposure to atmospheric ammoniac (0.84–1.07 mg/l ≈ 1/8 CL50/3h for intact animals) resulted in increasing mixed blood ammonia concentration 2.4 times compared with the isolated ethanol action. The ammonia inhalation promoted the lethal action of ethanol with a dose alteration factor of 0.81, suppressed the external respiration and the whole body oxygen consumption. These data suggest that in rat, the coma-inducing ethanol ingestion results in hyperammonaemia which is a consequence of the enhanced translocation of intestinal ammonia into the common bloodstream. On the basis of the data presented the alteration of the kinetics of endogenous ammonia appears to be a detrimental effect of acute ethanol intoxication.
Keywords: ethanol, rats, endogenous ammonia, atmospheric ammonia, hyperammonaemia, lethality
