Оригинальное научное произведение
«Создание наноструктур для обнаружения бактерий (NANOBAC) и терапевтических вмешательств»
(проект)
Авторы:
Финк
Кив Арик
Шунин Юрий
Альфонта Литал Ямна
Васик Юрий
Стефано Беллучи
Бурлукка Наталья
Гопеенко Виктор
Лобанова-Шунина Тамара
Жуковский Юрий
Меши Луиза
Фукс Давид
Дата создания:
26 января 2016 года
г. Алматы
СОДЕРЖАНИЕ
№№ п/п | стр. |
1 | Введение |
2 | Описание проекта |
3 | Основная часть |
4 | Методы исследования |
5 | Нанотехнологическая часть работы |
6 | Экспериментальная медико-биологическая часть работы |
5 | Ожидаемые результаты |
7 | Библиография |
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность. Создание новых многофункциональных наноструктур для диагностики ранних стадий бактериальных инфекционных заболеваний и их лечения является новейшим направлением медицины. Для этого мы предлагаем использование актуальных современных технологийв области физики, биофизики, биохимии и клеточной биологии длясоздания биосенсорныхнаноустройств с уникальными параметрами, позволяющими изучать бактериии разрабатывать новые методыдиагностики и терапиибактериальных инфекций, устойчивых к антимикробным препаратам. Предлагаемыйнанотехнологический подходк терапии инфекционных заболеваний представляет собой: созданиепринципиально новых биосенсорныхсистем на основе достиженийтрековой электроники; исследования поведения бактерий (invitro)в лабораторных условиях и придиагностике ранних стадий инфекционных заболеваний с использованием методов ядерной медицины; разработку новых систем доставки лекарственных препаратов на основе катионных наночастиц (мягких наночастиц).
Этот подход может потенциально революционизировать практику назначения антибиотиков и ограничить распространение устойчивости к противомикробным препаратам во всем мире. В процессе выполнения проекта будут изготовлены прототипы наноустройств, применимые в области смарт медицины для лечения распространенных бактериальных инфекционных заболеваний. Потенциальными потребителями являются: сфера здравоохранения, экологии, мониторинг окружающей среды, анализ продуктов питания.
Цель проекта
Разработка инновационных многофункциональных наноструктурдля диагностики ранних стадий бактериальных инфекционных заболеваний и их целенаправленного лечения в смарт медицине.
Основныезадачи проекта
1 Изучение и оценка существующихнаноструктур для обнаружения бактериальной инфекции.
2 Разработка, получение и тестирование новых многофункциональных наноструктур с заданными свойствами в целях ранней диагностики бактериальных инфекций и регулирования бактериальной сигнализации.
3 Разработка лабораторного технологического регламента производства и лабораторных методик контроля качества новой технологии диагностики ранних стадий бактериальных заболеваний с использованием наноструктур.
4. Разработка комплектов рабочей технической документации (ТД), конструкторской документации (КД) новой технологии наноструктур для лечения бактериальных заболеваний.
5 Изучение способов ингибирования QS систем в модельных системах
6Скрининг и доклинические исследования новыхнаноструктур для обнаружения бактериальной инфекции и ее лечения.
7 Проведение работ по обеспечению защиты прав интеллектуальной (промышленной) собственности.
Ключевые слова: трековая электроника, нанобиосенсоры, ранняя диагностика, бактериальные инфекционные заболевания, терапия.
ОПИСАНИЕ ПРОЕКТА
Проект включает в себя два взаимосвязанных блока: нанотехнологический и медико-биологический и его выполнение разделяется на три этапа.
Первыйэтап. Разработка новых наноструктур, используемых для обнаружения и изучения бактерий. Методами ядерной физики поры наностуктурмогут быть оптимизированы так, что бактерии смогут "комфортно вписываться"в них, таким образом, сочетая, топологическое сродство с их химическим сродством (адсорбцией), что открывает новые возможности для диагностики и лечении бактериальных заболеваний.
Второй этап. Созданиедиагностических и нанотерапевтических технологий с использованиемфеномена QS бактерий.
Третий этап. Проверка эффективности многофункциональных наноструктур с заданными свойствамии разработанных методов диагностики и лечения бактериальныхзаболеваний в лабораторных (invitro)и доклинических испытаниях.
Одной из особенностей проекта является применение теоретических методов компьютерного моделирования5 на всех этапах планируемой работы.
Научная новизна и практическая значимость проекта
Анализ, проведенный Европейской комиссией (COM 2011) показал, что "устойчивость к антимикробным препаратам (AМР) является глобальной проблемой мирового общественного здравоохранения [1]. Прогресс в улучшении результатов лечения инфекций сейчас находится в состоянии стагнации в связи с широким применением антибиотиков и изменчивостью бактериальных агентов[1]. Одним из эффективных способов решения этой проблемы является использование достижений современных нанотехнологий, в частности биологические наносенсорыдля профилактики и диагностики различных заболеваний.
ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ
Использование предлагаемого нанотехнологического подходак терапии инфекционных заболеваний представляет собой новый способ решения проблемы оптимальной антимикробной терапии и преодоления лекарственной устойчивости. Наноструктуры планируется использовать в трех основных направлениях:
1) Для создания принципиально новых биосенсорныхсистем на основе достиженийтрековой электроники(ТЭ)[2,3];
2) Для исследования поведения бактерий (invitro)в лабораторных условиях и придиагностике ранних стадий инфекционных заболеваний с использованием методов ядерной медицины;
3) Для разработки новых систем доставки лекарственных препаратов на основе катионных наночастиц (мягких наночастиц) при лечении инфекционных заболеваний.
Предлагаемые в данном проекте идеи создания и использования наноструктурявляются новыми и оригинальными. Участниками проекта была проведена большая работа, итогом которой является схематическая модель трекового биосенсора.
Предлагаемое устройство содержит заполненные электролитом трековые структуры [4]и подчинено стратегии массива, в котором соседние треки содержат различные ферменты. Этот подход является особенно ценным для ферментативных реакций, которые встречаются не только в одном треке, но и в нескольких последовательных треках. Биосенсор устроен так (см. рис.1), что все эти позиции-треки могут быть проверены последовательно один за другим в ряду соседних сенсорных полей с различными ферментами, включенными в ту же структуру, через которую проверяется поток биожидкости.
В одной из моделей устройств, для того, чтобы связать микроорганизм с поверхностью отображающей ферментна поверхности, линкер (содержащий алкин и тиольные фрагменты на противоположных концах) может быть синтезирован и особой связью присоединенк бактериальной дегидрогеназе через меднокаталитическуюазид-алкинную циклическую реакцию [5,6]. Используя этот способ, можно связать микроорганизмы с золотыми электродными проволоками, поверхностями с золотым покрытием и золотыминаночастицами. После связывания микроорганизма с поверхностью золота, жизнеспособность, а также каталитическая активность отображаемого фермента может оцениваться. Это один из примеров связыванияособой связью настоящего живого биологического гибрида с неорганическим материалом.
Впервые в мире технологиятрековыхнаноструктур будет использоваться для изучения и выявления индивидуального поведения бактерий. Созданные микропучками поверхностные узоры любой формы будут комбинироваться с латентными или отожженными ионнымитреками [2], чтобы создать субстраты, где клетки, связанныес узорами на обеих поверхностях имеют четко определенные прямые связи друг с другом через треки. Такие конфигурации позволяют детально исследоватькоммуникации между клетками. Обмен информацией с помощью сигнальных молекул может передаваться от клетки к клетке либо при непосредственном контакте (отожженный ионный трек), или путем диффузии через окружающую среду. Эта клеточная коммуникация может быть включена или выключена, например, путем нанесения термо-или рН - чувствительных гелей на стенки ионныхтреков, которые могут либо открыть либо закрыть трек, в зависимости от температуры фольги или величины рН, соответственно, таким образом позволяяпровести точные тесты клеточнойкоммуникации. Используя разработанные специфические маркерыбудет собираться комплексная информация о временной эволюции клеток [5].
Биологическим принципом, лежащим в основе проекта, является использование феномена «чувство кворума» QuorumSensing (QS). QuorumSensing (QS) – это особый тип регуляции экспрессии генов бактерий, зависящий от плотности их популяции. С помощью сигнальных молекул QS систем происходит межклеточная коммуникация бактерий в популяциях, обеспечивающая скоординированный ответ бактерий на изменение условий среды. Изучение биологической значимости регуляторных систем типа QS показало, что эти системы участвуют во взаимодействии многих бактерий с высшими организмами, животными и растениями, в регуляции вирулентности бактерий, формировании биопленок, регуляции экспрессии генов, связанных с синтезом различных экзоферментов, токсинов, антибиотиков и других вторичных метаболитов [3].Интерференция и модуляция QS и связанных с ними бактериальных процессов передачи сигналов будет обеспечивать новые возможности для контроля фактора вирулентности и терапии инфекций без использования антибиотиков, или в качестве альтернативы может усиливать эффективность ужесуществующих антибиотиков или других антимикробных соединений. Использование QS регуляции в качестве потенциальной мишени для борьбы с инфекционными заболеваниями рассматривается как новая перспективная стратегия антимикробной терапии[1].
Разработкановойнаноструктуры для направленной доставки «грузовых» молекул к бактериям в проекте находитсяна уровне самых современных и передовых методовнанотехнологий. Подход может потенциально революционизировать практику назначения антибиотиков при хронических инфекционных заболеваниях и ограничить распространение устойчивости к противомикробным препаратам во всем мире.
Выполнение проекта, как мы ожидаем, обеспечит значительный прорыв в понимании механизмов взаимодействия наноматериалов и биосреды, роли сигнальных молекул в поведении сообщества бактерий. Это расширит наши знания о природе QS, сигнальных биомолекул и механизмов формирования взаимодействия между контактирующими биообъектами и неорганическими наноструктурами на атомном уровне.
Проект будет содействовать дальнейшему прогрессу в преодолении растущего риска антимикробной резистентности (AMР) в мире.
В проекте будут участвовать ученые из Института ядерной физики, Чехия (ИЯФ, Ч); Бен-Гурион университета, Израиль (БГУ); Латвийского университета, Латвия ЛУ (создание наноструктур для обнаружения и исследования бактерий).
Будет осуществляться:функционализация неорганических материалов (ИЯФ, РК), компьютерное моделирование (РК, ЛУ, БГУ), микробиологические исследования, доклинические испытания (РК, БГУ, ЛУ). Реализация запланированной схемы исследований позволит создать алгоритм междисциплинарного сотрудничества для внедрения нанотехнологий в практическую медицину. Кооперация и координация профессиональных групп и институтов из разных стран, участвующих в проекте, даст опыт международного сотрудничества и позволит представлять результаты проекта на международном уровне. Полученные результаты необходимы для дальнейших прорывных результатов в развивающихся отраслях медицины Казахстана, развития смарт медицины.
Одним из конечных продуктов проекта будет новое семейство устройств, основанных на концепции TЭ с конкретными приложениями в био-зондировании;
Лидирующие группы – исследовательские институты из Европейского Союза, Израиля и США.
Методы исследования
Нанотехнологическая часть работы
Создание наноструктур с заданными свойствами.
Будут применяться методы трековой электроники (ТЭ) [2, 6-9]. Система KNOW-HOW будет использована для производства наноструктур. Источники ускоренных ионов в широком диапазоне энергий будут использоваться для формирования оптимальных рельефов поверхностей в тонких диэлектрических пленках при создании новых биосенсорных устройств для обнаружения и исследования бактерий. Созданные микролучевой технологией на поверхности структуры «узоры» любой формы могут комбинироваться с латентными или отожженными ионными трекамидля создания подложек, где клетки, связанные с узорами на обеих поверхностях имеют четко определенные прямые связи друг с другом через трековые структуры. Молекулярные механизмы клеточной адгезии будут изучаться с использованием данных об их пространственном расположении, совместной локализации и активации интегрина рецепторов адгезии и связанных с ними структурных и сигнальных белков, таких как паксиллин, талин, винкулина и киназы фокальной адгезии.
Адсорбция микроорганизмов в трековых стркутурах.
В создаваемых сенсорных устройствах для связывания микроорганизма с поверхностными ферментами, линкер-связующий фрагмент (содержащий алкин и тиольные фрагменты на противоположных концах) будет синтезирован и присоединен к бактериальной дегидрогеназе через меднокаталитическую азид-алкинную циклическую реакцию [6]. При использовании такого подхода можно будет связать микроорганизмы с золотыми электродными проволоками, поверхностями с золотым покрытием и золотыми наночастицами. После связывания микроорганизмов с золотой поверхностью будут проверяться их жизнеспособность, а также каталитическая активность.
Создание новых систем доставки на основе катионных наночастиц (мягких наночастиц, МН).
Будет выполняться синтез МН на основе липидомиметиков и их способности образовывать стабильную систему доставки с QS - антагонистами. Сигнальными молекулами для грамположительных бактерий будут выступать полигидроксильные фураны, аминокислоты (олигопептиды) или жирные кислоты, которые могут быть захвачены в наночастицах МН водородной связью (Н-связь). Это взаимодействие может быть доработано путем изменения амфифильных молекул, образующих МН.
Теоретические методы компьютерного моделирования будут использоваться для проектирования новых наноструктур, определения оптимальных комбинаций органических-неорганических веществ, функционализации неорганических субстратов для адсорбции бактерий.
В предлагаемом проекте будут использованы как апробированные теоретические и экспериментальные физические методы, основанные на известных фундаментальных соотношениях, так и известные методы компьютерного моделирования. Поэтому полученные результаты будут достоверны, и могут сравниваться с данными, полученными в рамках других подходов [9, 10].
Экспериментальная медико-биологическая часть работы
Эксперименты invitro по изучению роли QS систем в регуляции различных клеточных процессов бактерий. Микробиологические методы исследования
Оценка совместимости и эффективности QS-антагонистов и катионныхнаночастиц. Будут использоваться методы острой и субхронической токсичности на мышах.
Исследования острой токсичности нанопродуктов.
При изучении токсичности будут использованы различные виды животных, предпочтение отдается мышам, на которых возможно проведение массовых опытов с затратой наименьшего количества препарата.
Диагностика ранних стадий бактериальных заболеваний.
Для исследований эффективности биосенсорных систем для диагностики ранних стадий бактериальных заболеваний будут использоваться простейшие модели генерализованной инфекции (экспериментальный сепсис) на мышах.
Стандартные методы оценки антимикробной активности препаратов на этапах доклинического изучения
Объект исследования: новые нанопродукты, QS-ингибиторы и различные комбинации QS-ингибиторов с антибактериальными препаратами (антибиотики, наиболее часто используемые в клинических условиях), с антимикробными пептидами (AMП), компонентами иммунной системы беспозвоночных животных. Использование АМП для ингибирования образования биопленки потенциально является привлекательным терапевтическим подходом.
Оценка спектра действия и степени антибактериальной активности invitro новых продуктов будет проводиться в отношении определенного набора штаммов (чувствительных и устойчивым к антибиотикам). Определение антибактериальной активности и спектра антимикробного действия будет проводиться методом двухкратных серийных разведений в жидкой и плотной питательных средах. Условия определения (питательная среда, число и характеристика штаммов, особенности культивирования, сроки учета результатов) зависят от вида возбудителя.
Выявление скорости формирования устойчивости к антибиотикам, способности оказывать разрушающее воздействие на макромолекулярные структуры бактериальной клетки новыхнанопродуктов. Метод – определение уровня внутриклеточного фрагмента бактериальной клетки – в-галактозидазы (маркер белкового синтеза в клетках Escherichiacoli). В присутствии веществ, подавляющих синтез белка происходит снижение скорости синтеза в-галактозидазы.
Испытания будут осуществляться в доклинических лабораториях, имеющих соответствующие разрешения (Казахстан, Чехия, Израиль). Гарантией достоверности результатов доклинических исследований служит проведение исследования в соответствии с принципами GLP «Надлежащая лабораторная практика» и правилами доклинических (неклинических) исследований в Республике Казахстан, утвержденными приказами Министра здравоохранения Республики Казахстан № 000 от 12 ноября и № 000 от 01.01.01 года. При проведении экспериментов будут соблюдаться принципы гуманного отношения к животным в соответствии с международными правилами «Guideforthe Саге andUseofLaboratoryAnimals». Все исследования, связанные с животными, будут утверждаться этическим комитетом учреждения, где будут проводиться исследования, согласно законодательству страны нахождения.
В процессе выполнения проекта планируется безусловное обеспечение соблюдения принципов научной этики, т. е. этических процедур управления, в частности, поддержания высоких стандартов интеллектуальной честности и недопущения фабрикации научных данных, фальсификации, плагиата, ложного соавторства, использования отдельными участниками коллективных исследований, данных и выводов, полученных в исследованиях, без согласования с другими участниками.
Имеется вся необходимая техническая база, лабораторные и производственные помещения, компьютерная и офисная техника. Требуются дополнительные вычислительные ресурсы для проведения компьютерного моделирования и визуализации полученных результатов. Во время командировок предполагается безвозмездное использование зарубежных исследовательских инфраструктур (лабораторий) партнеров проекта.
Критическими точками в реализации проекта являются несвоевременное поступление финансирования и бюрократические процедуры при оплате работы зарубежных партнеров. Кроме того, поломка оборудования может привести к увеличению длительности выполнения проекта.
Условия оформления и разделения прав на объекты интеллектуальной собственности, созданные в результате исследования будут оговариваться между участниками проекта и оформляться соответствующими соглашениями. Способы защиты интеллектуальной собственности будут определяться патентным законом РК.
Полученные промежуточные результаты по теме Проекта будут докладываться на международных научных конференциях, а также будут обсуждаться в период командировок на научных семинарах в крупных научных центрах дальнего зарубежья. Это будет способствовать эффективности исследований в рамках Проекта и распространению результатов. Научные командировки будут способствовать повышению квалификации молодых ученых, участвующих в проекте, и расширения их связей с известными и молодыми учеными дальнего зарубежья.
Организация-заявитель проекта подключена к мобильному Интернету 3G/4G. Научные сотрудники неоднократно выполняли заказ по изучению и совершенствованию методов диагностики и лечения инфекционных заболеваний, имеют опыт работы в доклинических исследованиях. Для проведения исследования имеется лицензия на научную деятельность.
Организация-заявитель проекта имеет государственную регистрацию, научный состав сотрудников неоднократно работал по проведению прикладных и фундаментальных научных исследований в области здравоохранения.
Основная часть работ будет выполнена на территории Казахстана с привлечением зарубежных специалистов.
ОЖИДАЕМЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ
Планируется осуществление публикаций в рейтинговых журналах, индексируемых компанией ThomsonReuters, и обладающих ненулевымимпакт-фактором. Полученные результаты будут докладываться на международных конференциях, проходящих в разных странах, а также обсуждения результатов будут проходить на международных семинарах. Сотрудничество ключевых специалистов Казахстана, ЕС и Израиля будет способствовать успешному выполнению работ в рамках проекта.
Запланированные результаты патентоспособны. При необходимости будут оформляться заявки на изобретения, заключаться лицензионные соглашения по объектам интеллектуальной собственности.
Новые наноустройства значительно увеличат возможности проведения научных измерений в области микрообъектов на Земле, в космосе и в подводных условиях. Проект расширит наши знания в понимании механизмов взаимодействия наноматериалов и биосреды, роли сигнальных молекул в феномене QR бактерий.
Проект повлияет на стратегические проблемы применения нанотехнологий в медицине. Реализация проекта позволит разработать новые методы, повышающие эффективность лечения инфекционных заболеваний и устраняющие устойчивость к антибиотикам.
Новые знания и инновации, ожидаемые от результатов проекта:
Новые подходы к изучению механизмов поведения бактерий и их коммуникаций на основе применения новых наноструктур и достижений трековой электроники (TЭ);
Исследования в области изготовления органически модифицированных неорганических поверхностей и наноструктур на основе оригинальных экспериментов и теоретического моделирования;
Изготовление нового семейства электронных устройств, основанных на концепции TЭ с конкретными приложениями в био-зондировании;
Новые подходы к терапии бактериальных инфекционных заболеваний.
Проект даст мультипликативный эффект для народного хозяйства и обусловлен следующими потребностями рынка, такими как:
-инновационные технологии для надежного и экономически эффективного мониторинга окружающей среды,
-анализ продуктов питания,
-обнаружение воздушных патогенов и био-токсинов (что также важно для разработки антитеррористических систем безопасности),
- потребности в сфере здравоохранения.
Полученные научные результаты будут востребованы: при лечении и профилактике инфекционных заболеваний, в экологии, фармацевтике, целевой доставке лекарств и протеинов, в клинической и медицинской диагностике, для развития наноиндустриальных производств.
Целевые потребители полученных результатов – работники здравоохранения, исследователи окружающей среды, фармакологи;
Реализация новых подходов к терапии бактериальных инфекционных заболеваний значительно повысит конкурентоспособность Казахстана на рынке нанотехнологий биомедицинского направления. Риски невыполнения минимальны, так как работа будет выполняться опытными сотрудниками, с привлечением зарубежных ученых и специалистов, которые обладают достаточной квалификацией. Полученные результаты будут общим вкладом в развитие нанотехнологий и медицинской науки Казахстана.
Распространение результатов работы будет происходить путем публикаций, интерактивного общения, выступлений на семинарах, конгрессах по разным дисциплинам и широкого освещения в СМИ.
БИБЛИОГРАФИЯ
Action plan against the rising threats from Antimicrobial Resistance, COM (2011) 748 final, Brussels, 15.11.2011. Fink D., Munoz H. Gerardo, Alfonta L., Mandabi Y., Dias J. F., de Souza C. T., Bacakova L. E., Vacik J., Hnatovicz V., Kiv A. E., Fuks D. and Papaleo R. M. (2012) Status and Perspectives of Ion Track Electronics for Advanced Biosensing. in: ‘Nanodevices and nanomaterials for ecological security’. NATO Series B: Physics and Biophysics, Eds. Shunin Y. and Kiv, A., Springer, 2012, pp. 269-280. Alfonta L., Bukelman O., Chandra A., Fahrner W. R., Fink D., Fuks D., Hnatowicz V., Hoppe K., Kiv A., Klinkovich I., Landau M., Vacik J., Valden M. (2009) Strategies towards advanced ion track-based biosensors, Rad. Effects & Defects Solids 164:431–437. Fink D., Munoz H. G., Vacik J., Alfonta L. (2011) IEEE Sensors J. 11:1084. Fink D., Munoz H. G., Alfonta L. (2011) Ion track-based urea sensing. Sensors and Actuators B 156:467-470. Amir L., Tam T. K., Pita M., Meijler M. M., Alfonta L., Katz E. (2008) Biofuel cell controlled by enzyme logic systems. Journal of the American Chemical Society 131(2): 826-832. Fink D., Klinkovich I., Marks R. S., Kiv A., Fuks D., Fahrner W. R., Alfonta L. (2009) Biosensors and Bioelectronics 24:2702, DOI: 10.1016/j. bios.2008.12.001D. Allesen-Holm M., Barken K. B., Yang L., Klausen M., Webb J. S., Kjelleberg S. , Molin S., Givskov M. and Tolker-Nielsen T. (2006) A characterization of DNA release. In Pseudomonas Aeruginosacultures and biofilms. Mol. Microbiol. 59:1114–1128. Bacakova L., Grausova L., Vacik J., Lavrentiev V., Blazewicz S., Fraczek A., Kromka A., Haenen D. (2011) Nanoscience and Nanotechnology Letters 3: 99-109. DOI: 10.1166/nnl.2011.1127. Devise for treating pieces of a substrate at high pressure with a supercritical or near-critical treatment medium, piece by piece or in batches, EP1681387, NL1028037.
