УДК 579.87; 577.29
1, 1, 1, Т. Ули-Маттила2
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММОВ ЭНТОМОПАТОГЕННЫХ ГРИБОВ РОДА LECANICILLIUM (=VERTICILLIUM LECANII s. l. )
Mitina G. V. 1, TokarevYu. S. 1, Kazartsev I. A. 1, Yli-Mattila T.2
THE MOLECULAR GENETIC CHARACTERISTICS OF THE ENTOMOPATHOGENIC FUNGAL STRAINS FROM GENERA LECANICILLIUM (=VERTICILLIUM LECANII s. l.)
1 Всероссийский институт защиты растений Россельхозакадемии, Санкт-Петербург, Россия
1 All-Russian Institute of Plant Protection, Russian Academy of Agricultural Sciences, Saint-Petersburg, Russia
2 Университет города Турку, Финляндия
2 University of Turku, Turun Yliopisto, Finland
*****@***ru
Проведена видовая идентификации энтомопатогенных анаморфных аскомицетов из рода Lecanicillium (бывший комплексный вид Verticillium lecanii Zimm. Viegas) на основе анализа сиквенсов митохондриального гена nad1. Среди 39 изученных изолятов самым многочисленным оказался вид L. muscarium (около 70 % от общего количества проанализированных штаммов, собранных из различных источников, прежде всего из насекомых отряда Homoptera, были собраны на территории России). Один штамм отнесен к виду L. longisporum и два штамма отнесены к виду L. psalliotae. Сходства сиквенсов с референтными штаммами было на уровне 99-100%. Для изолятов L. muscarium выявлено 4 молекулярных гаплотипа гена nad1, описанных ранее: гаплотип А составил 51,4 % от общей выборки; гаплотип В - 25,7%; гаплотип C - 14,3%; гаплотип D - 8,6%. Для гаплотипа C обнаружена приуроченность к определенной географической зоне, ограниченной Грузией, Аджарией и Краснодарским краем. Анализ морфометрических показателей штаммов, относящихся к разным гаплотипам L. muscarium и к разным видам показал отсутствие четких границ между различными группами штаммов.
Ключевые слова: систематика, энтомопатогенные грибы, Lecanicillium spp. (=Verticillium lecanii s. l.), митохондриальная ДНК, nad1, внутривидовой полиморфизм.
A region of the mitochondrial gene nad1 was sequenced for species identification of entomopathogenic anamorphic ascomycetes of the genus Lecanicillium (former complex species Verticillium lecanii Zimm. Viegas). Among 39 isolates under investigation Lecanicillium muscarium was the most numerous species (about 70% of all isolates collected in Russia on the different hosts, predominantly on the insect from the order Homoptera). One strain was identified as species L. longisporum and two as L. psalliotae. The sequence similarity of the examined isolates to the reference strains was 99-100%. The presence of four molecular haplotypes, described earlier, was found among the species Lecanicillium muscarium. The quote of haplotype A among L. muscarium strains was 51,4 %; haplotype B - 25,7%; haplotype C - 14,3%; haplotype D - 8,6%. Only haplotype C showed specific association with a certain geographical area, limited Georgia, Adjara and the Krasnodar Territory. The analysis of the morphometric parameters of isolates which belong to different haplotypes or species showed no clear boundaries between the different groups of the strains.
Key words: systematics, entomopathogenic fungi, Lecanicillium spp. (Verticillium lecanii s. l.), mitochondrial DNA, nad1, intraspecific polymorphism.
Анаморфные аскомицеты Lecanicillium spp. (ранее классифицированные как один вид Verticillium lecanii (Zimmerman) Viegas Vuillemin) являются природными патогенами, встречающимися преимущественно на насекомых из отряда Homoptera (тлей, белокрылок, трипсов и кокцид) (Evlachova, 1939; Hall, 1976, 1981). Впервые вид Verticillium lecanii (Zimm.) Viegas был отмечен как паразит щитовок на о. Цейлон (Petch, 1925). Дальнейшими исследованиями было показано, что Lecanicillium spp. имеют повсеместное распространение и поражают широкий круг хозяев, включая насекомых, клещей, нематод и фитопатогенные грибы (Askary et al., 1998; Goettel et al., 2008; Hдnssler, Hermanns, 1981; Heintz, Blaich, 1990). В последние годы изменились представления об экологической роли этих видов энтомопатогенных грибов (Goettel et al., 2008; Bruck, 2010). Так, было установлено, что виды Lecanicillium могут вызывать индуцированную устойчивость у корней растений против фитопатогенных грибов (Ownley et al., 2010). Это повышает к ним интерес не только в качестве микробиологических средств контроля численности сосущих вредителей, среди которых наиболее известны препараты Mycotal (против белокрылок) и Vertalec (против тлей) (Hall, 1984; Faria, Wraight, 2007), но и как антагонистам ржавчинных и мучнисторосяных фитопатогенных грибов (Benhamou & Brodeur 2000; Kim et al., 2007, 2008; Vandermeer et al., 2009).
Природные изоляты бывшего вида V. lecanii проявляют большое разнообразие по патогенности, биологическим и биохимическим признакам (Hall, 1981; Аванесов, 1986; Митина и др., 1997). Однако морфологические признаки не позволяют дифференцировать их как отдельные виды, поскольку характерные морфологические особенности у анаморфных аскомицетов выражены весьма слабо. Прорыв в современных методах молекулярной биологии привел к глобальным изменениям в систематике несовершенных грибов. Вид V. lecanii определен как комплексный, включающий в себя отдельные таксоны. В настоящее время проведена ревизия всего рода Verticillium секции Prostrata, которая привела к введению нового рода Lecanicillium W. Gams at Zare на основе секвенирования внутреннего транскрибируемого спейсера ITS, гена бета-тубулина и ряда митохондриальных генов (Zare et al., 2000, 2001; Zare, Gams, 2001; Sung et al., 2001). В результате комплексного молекулярного анализа и с учетом хозяинной принадлежности были выделены такие виды рода Lecanicillium, как Lecanicillium lecanii, патоген червецов и щитовок, Lecanicillium longisporum, патоген тлей, Lecanicillium muscarium, патоген белокрылок (Zare et al., 2001a). Морфологически последние два вида различаются только размерами конидий. Однако, «среднеспоровые» изоляты Lecanicillium spp. также широко распространены в природе и могут паразитировать на тлях, белокрылках и фитопатогенных грибах. Видовая идентификация таких изолятов при использовании только классических таксономических характеристик по современной номенклатуре невозможна.
В настоящее время в Международной базе данных нуклеотидных последовательностей (INSD) представлен значительный массив информации об участках различных генов грибов рода Lecanicillium. Среди них хорошо изучен ген бета-тубулина, который был использован для исследования полиморфизма внутри рода Lecanicillium (Zare and Gams, 2001), а также митохондриальные гены NADH-дегидрогеназы и ITS-регионов рибосомальной РНК, которые были использованы для идентификации новых энтомопатогенных видов Lecanicillium и Verticillium sensu lato (Kouvelis et al., 2004; Kouvelis et al., 2004). Cреди трех изученных митохондриальных локусов наиболее информативным оказался митохондриальный ген NADH-дегидрогеназы (nad1) (Kouvelis et al., 2008).
Во ВНИИ защиты растений (ВИЗР) собрана большая коллекция изолятов Lecanicillium spp. (=Verticillium lecanii s. l.), которые длительное время являются объектами изучения в качестве продуцентов экологически безопасных биопрепаратов для защиты растений от сосущих вредителей и биологически активных соединений (Павлюшин, 1983; Митина и др., 2001; Митина, Павлюшин, 2011). Все представленные в коллекции штаммы были идентифицированы ранее как Verticillium lecanii s. l. или Verticillium sp. Вместе с тем, изоляты имеют различное географическое происхождение и гостальную специфичность, также установлен высокий уровень дивергенции по патогенным свойствам. При этом морфологически эти штаммы очень близки; так, по размеру конидий большинство природных изолятов Lecanicillium spp. относится к среднеспоровым и мелкоспоровым и на основании этого признака не могут быть однозначно отнесены к L. longisporum или L. muscarium (Mitina et al., 2008). Кроме того, в очагах эпизоотий, где были выделены эти изоляты, при отсутствии подходящего хозяина происходило заражение насекомых других отрядов или фитопатогенных грибов. Определение этих видов по современной номенклатуре невозможно без использования молекулярных методов.
Таким образом, целью работы было использовать для ранее исследованных и отобранных по патогенным свойствам перспективных штаммов, а также новых изолятов комплексного вида Verticillium lecanii s. l. достоверный метод молекулярной идентификации, позволяющий определить их видовую принадлежность в соответствии с современной номенклатурой и провести филогенетический анализ для выявления родственных связей этой группы анаморфных аскомицетов. Предварительные молекулярные исследования, выполненные на основе секвенирования участка митохондриального гена NAD1 на небольшой выборке штаммов, показали перспективность этого маркера для идентификации видов грибов рода Lecanicillium согласно современной систематике и позволили выявить генетический полиморфизм внутри вида Lecanicillium muscarium (Митина и др., 2013).
Материалы и методы
В работе использовано 39 изолятов гриба Lecanicillium spp., выделенных из насекомых отряда Homoptera (белокрылки, тли, кокциды), растительноядных клещей, фитопатогенных грибов и почвы и имеющих различное географическое происхождение (табл.1). Изоляты хранятся в коллекции энтомопатогенных грибов лаборатории микробиологической защиты растений ВИЗР и являются частью Государственной Коллекции микроорганизмов, патогенных для растений и их вредителей ВИЗР (WFCC WDCМ № 000).
Экстракцию ДНК проводили экспресс-методом из грибного мицелия с помощью системы CTAB/хлороформ (Doyle, Doyle, 1987), которая была адаптирована применительно к энтомопатогенным грибам. Штаммы выращивали на жидкой глюкозо-пептонной среде в эппендорфах в течение 2-х суток, нативный раствор от мицелия отделяли центрифугированием.
Для ПЦР использовали стандартные компоненты. Одна реакция (25 мкл) содержала: 1 мкл экстракта ДНК, 200 мкМ dNTP, по 0,5 мкМ каждого праймера, 1 единица Taq-полимеразы, 10 % 10Ч буфера (750 мМ tris-HCl, рН = 8.8; 200 мМ (NH4)2SO4; 20 мМ MgCl2; 0.1 % Tween 20).
Для амплификации участка митохондриального гена nad1 использовали праймеры NAD1A (5'- ATG GCS*AGT ATG CAA AGA AGA -3') и NAD1B (5'- GCA TGT TCT GTC ATA AAS* CCA CTA AC -3'), показавшие высокую специфичность для различных видов энтомопатогенных грибов (Kouvelis et al., 2008). Для амплификации с этими праймерами использовали стандартную программу: предденатурация – 95 °С 4 мин, денатурация – 92 °С 30 с, отжиг – 55 °С 30 с, элонгация – 72 °С 1 мин (последние три этапа повторялись 36 раз), финальная элонгация – 72 °С 5 мин, охлаждение до 12 °С. Ампликоны разделяли с помощью электрофореза в 1%-ном геле при напряжении электрического поля 80 V, в качестве буфера использовали 0,5Ч TBE.
Для окрашивания геля использовали бромистый этидий (0.2 мкг/мл). Визуализацию и документирование результатов электрофореза проводили с помощью ChemiDoc™ MP System (Bio-RAD). В качестве стандарта использовали маркер Generuler 100 bp DNA Ladder (Thermo Scientific).
Ампликоны вырезали непосредственно из геля, после чего проводили их очистку (Malferrari et al., 2002). Данные методики исследования были успешно апробированы для определения новых видов фитопатогенных грибов (Берестецкий и др., 2013; Гасич и др., 2013).
Секвенирование проводили по классическому методу обрыва цепи на генетическом анализаторе ABI Prism 3500 в соответствии с указаниями производителя (Applied Biosystems). Полученные сиквенсы сравнивали с референтными последовательностями, представленными в GenBank на сервере NCBI.
Для статистического и филогенетического анализов полученные сиквенсы были отредактированы в приложении BioEdit (Hall, 1999) и проверены на сходство с таковыми, депонированными в Генбанке с помощью встроенной утилиты BLAST (http://ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi) с применением алгоритма discontinuous megablast. Для филогенетических построений были подобраны гомологичные референтные сиквенсы, депонированные в Генбанке, для каждого из видов рода Lecanicillium sensu Kouvelis et al. (2008) таким образом, чтобы уровень дивергенции нуклеотидных последовательностей выбранных изолятов был максимальным в пределах каждого вида. В качестве внешней группы был выбран Metarhizium anisopliae. Нуклеотидные последовательности были загружены в BioEdit, выравнены методом Clustal X Multiple Alignment; позиции сравнения, содержащие пропуски, были удалены. Матрица данных была конвертирована в файл формата NEX. Филогенетическое построение выполнено методом байесовского заключения (БЗ) в программе MrBayes 3.1.2 [Ronquist, Huelsenbeck, 2003] с использованием стандартных настроек модели GTR+I+G с циклом в 1000000 поколений, по истечении которых стандартное отклонение расщеплённых частот достигло 0,006. Полученная филограмма была отформатирована в приложении TreeView (http://taxonomy. zoology. gla. ac. uk/rod/rod. html).
Результаты и обсуждение
Для всех изолятов рабочей выборки, перечисленных в таблице 1, был амплифицирован и секвенирован участок митохондриального гена nad1 протяженностью около 500 н. о. Для сравнительного анализа нуклеотидные последовательности были отредактированы и выравнены, протяженность элайнмента составила 441 н. о.
В результате сравнения полученных нуклеотидных последовательностей с таковыми, доступными в Генбанке, было установлено, что 35 штаммов однозначно идентифицируются как L. muscarium на основании сходства сиквенсов с референтными штаммами (№ последовательности Генбанк, № последовательности Генбанк). на уровне 99-100% Кроме того, один из штаммов, Vl 13, продемонстрировал сходство сиквенсов равное 99.6 % с последовательностью референтного штамма L. longisporum (изолят Vertalec, номер доступа в Генбанке EF512914), что свидетельствует о его принадлежности к данному виду. Сиквенсы еще двух штаммов, Vl 78 и Vl 79, имели сходство 99.3-99.5% с сиквенсом референтного штамма L. psalliotae ARSEF 2234 (номер доступа в Генбанке EF512962), что предполагает принадлежность указанных штаммов именно к этому виду (табл.1). Сходство между сиквенсами штаммов Vl 78 и 79 составило 99.7 %, различие заключалось в одной нуклеотидной замене класса транзиции (A/G) в позиции 430 (номер позиции указан относительно референтного сиквенса EF512962). Наконец, штамм Vl 77 показал сходство с референтным штаммом L. muscarium (изолят C42, номер доступа в Генбанке AF487277) на 97.1%, что не позволяет сделать однозначный вывод о принадлежности штамма Vl 77 к этому виду, поскольку обычно уровень сходства сиквенсов nad1 для изолятов L. muscarium выше. Кроме того, на филогенетическом дереве этот штамм несколько обособлен от представителей L. muscarium, занимая по отношению к ним базальное положение (рис. 2).
В целом, L. muscarium заметно преобладал в выборке штаммов, собранных на территории России из различных источников, прежде всего из насекомых семейства Homoptera (около 70 % от общего количества проанализированных штаммов).
Для 35 изолятов L. muscarium выявлено 4 молекулярных гаплотипа гена nad1, описанных ранее: гаплотип А (= гаплотип II sensu Mitina et al., 2013), 51,4 % от общей выборки; гаплотип В (= гаплотип III sensu Mitina et al., 2013), 25,7%; гаплотип C (= гаплотип I sensu Mitina et al., 2013), 14,3%; гаплотип D (= гаплотип IV sensu Mitina et al., 2013), 8,6%.
Все четыре гаплотипа имеют Голарктическое распространение. Большая часть штаммов, принадлежащих к этим гаплотипам, была выделена в Центральной части России и преимущественно из насекомых отряда Homoptera (13 штаммов). Три штамма изолировано из других членистоногих и 1 штамм из ржавчинных грибов. Характерно, что среди 5 изолятов из мировых коллекций ARSEF и IMI, также относящихся к гаплотипу B, нет ни одного штамма, выделенного из Homoptera, они были выделены из Coleoptera, Diptera и Lepidoptera. Среди представителей гаплотипа A из CBS и ARSEF коллекций, напротив, встречаются штаммы, выделенные из Homoptera (EF512937, EF512929) и один изолят из Hymenoptera (EF512920). Кладистическое распределение референтных сиквенсов на филограмме полностью соответствовало топологии филогенетического дерева в работе Kouvelis et al. (2008) с достаточно высокими значениями постериорной вероятности (posterior probability) в качестве поддержки ветвей, соответствующих отдельным видам рода Lecanicillium (рис.1). Уникальный гаплотип C, представленный 5 штаммами, имел сходство 98,9% с единственным представленным в Генбанке штаммом IMI 321393, выделенным в Колумбии из ржавчинных грибов. В то же время, 4 штамма нашей коллекции были выделены из насекомых отряда Homoptera и один из ржавчинных грибов. Таким образом, выявленный спектр гостальной специфичности у изученных грибов (включая случаи выделения L. muscarium из ржавчинных грибов), в целом совпадает с таковым, обнаруживающимся при рассмотрении мировой выборки, представленной в Генбанке.
Если рассматривать штаммы, выделенные только в природных условиях, исключив те, которые были выделены в теплицах (Vl 59 и Vl 11), то гаплотип C демонстрирует приуроченность к определенной географической зоне. Так, находки 4 штаммов гаплотипа C территориально были ограничены Грузией, Аджарией и Краснодарским краем. что можно рассматривать как узкую географическую распространенность данного гаплотипа. Впрочем, для окончательного заключения о степени его эндемичности выборка слишком мала; требуется дальнейшее изучение генетической структуры природных популяций L. muscarium в указанных районах и в соседних областях.
В уникальном гаплотипе D природными можно считать только два изолята (40 и 49), которые оказались были выделены в значительном удалении (Камчатка и Йошкар-Ола). от остальных гаплотипов.
Анализ морфометрических показателей штаммов, относящихся к разным гаплотипам L. muscarium и к разным видам показал отсутствие четких границ между различными группами штаммов. В частности, размеры конидий L. muscarium составили от 2.0 до 6.5 мкм по длине и от 0.6 до 2.8 мкм по ширине, а конидии L. longisporum (Vl 13) имели размеры 5.4-5.7 Ч2.2-2.4. Большинство изученных штаммов L. muscarium (около 70%) можно отнести к среднеспоровым, у которых длина конидий составляла 3-4 мкм. У 10% изученных штаммов длина конидий не превышала 2.2 мкм (мелкоспоровые). Остальные штаммы, включая и L. longisporum имели более крупные споры (от 5 мкм). Согласно современной классификации изоляты, относящиеся к виду L. longisporum (Petch) Zare et W. Gams имеют размеры конидий 5.0-12.5 Ч 1.6-3.4 мкм, а к виду L. muscarium (Petch) Zare et W. Gams – 2.5-6.0 Ч 1.0-1.8 мкм (Zare, Gams, 2001), что не противоречит полученным данным, однако, не является достаточным признаком для дифференциации видов.
Таким образом, на основе анализа сиквенсов митохондриального гена nad1 все изученные штаммы, отнесенные ранее к комплексному виду V. lecanii были идентифицированы по современной систематике, среди них были выявлены представители трех видов, причем самым многочисленным оказался вид L. muscarium. Использование участка гена nad1 мтДНК позволило также изучить генетический полиморфизм и выявить уникальные гаплотипы внутри вида L. muscarium.
Благодарности
Авторы выражают благодарность (Москва) и М. Согонову (Beltsville, MD, USA) за предоставленные для исследований изоляты грибов. Работа поддержана грантом РФФИ №13-04-01905 и грантами научного обмена Академии наук Финляндии № 000 в 2013-2014 годах.
Литература
Avanesov S. G. The biological basis of the selection of the virulent strains of the entomopathogenic fungi Verticillium lecanii (Zimm.).1987. 19 p. (in Russian).
Benhamou N, Brodeur J. Evidence for antibiosis and induced host defense reactions in the interaction between Verticillium lecanii and Penicillium digitatum, the causal agent of green mold. Phytopathology. 2000. Vol. 90. P. 932 – 943.
Berestetskiy А. О., Terletskiy V. M., Gannibal Ph. B., Kazartsev I. A., Khodorkovskii М. А. The characteristics of Eurasian isolates of Alternaria sonchi by cultural, molecular, physiological and biochemical characters // Mikologiya i fitopatologiya. 2013. Vol. 47, N 2. P. 120–128 (in Russ.).
Borisov B. A. The problems of creation and using of mycoinsecticidal preparations / The study of entomopathogenic microorganisms and development of technologies for their production and use. Romania. Bucharest. 1990. P. 8-22.
Bruck, D. J. Fungal entomopathogens in the rhizosphere // Bio Control. 2010. Vol. 55. P. 103–112.Doyle, J. J. and J. L. Doyle. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue // Phytochemical Bulletin. 1987. Vol. 19. P. 11–15.
Evlahova A. A. Using of the entomopathogenic fungus Cephalosporium lecanii Zimm. for control of citrus scale // Doklady VASHNIL. 1939. Vol.11. P. 11–22.
Faria M. R., Wraight S. P. Mycoinsecticides and mycoacaricides: a comprehensive list with worldwide coverage and international classification of formulation types // Biological Control. 2007. Vol. 43. P. 237–256.
Gasich E. L., Kazartsev I. A., Gannibal Ph. B., Koval A. G., Shipilova N. P., Khlopunova L. B., Ovsyannikova E. I. Calonectria pseudonaviculata — a new for Abkhazia species, the causal agent of boxwood blight // Mikologiya i fitopatologiya. 2013. Vol. 47, N 2. P. 129–131 (in Russ.).
Goettel M. S., Koike M., Kim J. J., Aiuchi D., Shinya R., Brodeur J. Potential of Lecanicillium spp. for management of insects, nematodes and plant diseases // J. Invertebr Pathol. 2008. 98:256–261
Hall T. A. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT // Nucleic. Acids Symp. Ser. 1999. Vol. 41. P. 95–98.
Hall, R. A. The fungus Verticillium lecanii as a microbial insecticide against aphids and scales / Microbial Control of Pests and Plant Diseases 1970-1980 / Ed. H. D. Burges. New York: Academic Press. 1981. P. 483–498.
Hall, R. A. Verticillium lecanii on the aphid, Macrosiphoniella sanborni // Journal of Invertebrate Pathology. 1976. Vol.28, N 3. P. 389–391.
Heintz C., Blaich. R. Verticillium lecanii as a hyperparasite of grapevine powdery mildew (Uncinula necater) // Vitis. 1990. Vol. 29. P. 229–232.
Hӓnssler G., Hermanns M. Verticillium lecanil as a parasite on cysts of Heterodera schachtii // Zeitschrift ffir Pflanzenkrankheiten und Pflanzenschutz. 1981. Vol. 88. P. 678–681.
Kim J. J., Goettel M. S., Gillespie D. R. Evaluation of Lecanicillium longisporum, Vertalec for simultaneous suppression of cotton aphid, Sphaerotheca fuliginea, on potted cucumbers // Biological Control. 2008. Vol. 45. P. 404–409.
Kim J. J., Goettel M. S., Gillespie D. R. Potential of Lecanicillium species for dual microbial control of aphids and the cucumber powdery mildew fungus, Sphaerotheca fuliginea // Biological Control. 2007. Vol. 40. P. 327–332.
Kouvelis V. N., Ghikas D. V., Typas M. A. The analysis of the complete mitochondrial genome of Lecanicillium muscarium (synonym Verticillium lecanii) suggests a minimum common gene organization in mtDNAs of Sordariomycetes: phylogenetic implications // Fungal Genetics and Biology. 2004. Vol. 41. P. 930–940.
Kouvelis V. N., Sialakouma A., Typas M. A. Mitochondrial gene sequences alone or combined with ITS region sequences provide firm molecular criteria for the classification of Lecanicillium species // Mycol. Res. 2008. Vol. 112. № 7. P. 829–844.
Kouvelis V. N., Zare R., Bridge P. D., Typas M. A. Differentiation of mitochondrial subgroups in the Verticillium lecanii species complex // Letters in Applied Microbiology. 1999. Vol. 28. P. 263–268.
Kuter GA. 1984. Hyphal interaction between Rhizoctonia solani and some Verticillium species // Mycologia 76:936 – 940.
Malferrari G., Monferini E., DeBlasio P., Diaferia G., Saltini G., Del Vecchio E., Rossi-Bernardi L., Biunno I. High-quality genomic DNA from human whole blood and mononuclear cells // BioTechniques. 2002. Vol 33, № 6. P. 1228–1230.
Mendgen K, Casper R. Detection of Verticillium lecanii in pustules of bean rust (Uromyces phaseoli) by immunofluorescence // J. Phytopathol. 1980. Vol. 99: 362 – 364.
Mitina G., Mikhailova L. Yli-Mattila T. RAPD-PCR, UP-PCR and rDNA sequence analyses of entomopathogenic fungus Verticillium lecanii and its pathogenicity towards insects and phytopathogenic fungi // Archives of Phytopatology and Plant Protection. 2008. Vol. 41. № 2. P. 113–128.
Mitina G. V., Pavlyushin V. A. The increasing of effectiveness of blastospores of entomopathogenic fungus Lecanicillium muscarium (=Verticillium lecanii) by modern formulations // IOBC/WPRS Bulletin. 2011. N 42. P. 135–137 (in Russian).
Mitina G. V., Pavlyushin V. A., Naumov V. A. Collection of entomopathogenic fungi: Catalogue of State collection of useful and harmful organisms. Moscow-St. Petersburg. 2001. P. 12–14 (in Russian).
Mitina G. V., Sergeev G. E., Pavlyushin V. A. Relation between morphological and biochemical peculiarities and the virulence to orhard whitefly in wild isolates of Verticillium lecanii (Zimm.) Viegas // Mikologiya i fitopatologiya. 1997. Vol. 31, N 1. P. 57–64 (in Russ.).
Mitina G. V., Tokarev Yu. S., Yli-Mattila T. Species identification of entomopathogenic fungi from genera Lecanicillium (=Verticillium lecanii s. l.) by molecular markers // Evraaziatskij entomologicheskij zhurnal. 2013. № 5. P. 431– 437.
Ownley B. H., Gwinn K. D., Vega F. E. Endophytic fungal entomopathogens with activity against plant pathogens: ecology and evolution // BioControl. 2010. Vol.55. N 1. P. 113–128.
Ownley B. H., Griffin M. R., Klingeman W. E., Gwinn K. D., Moulton J. K., Pereira R. M. Beauveria bassiana: endophytic colonization and plant disease control // J Invertebr Pathol. 2008. Vol.3. P. 267–270.
Pavlyushin V. A. Using of the entomopathogenic fungus Verticillium lecanii for control of whitefly in greenhouses: Biological control of pests and plant diseases in greenhouses. Riga. 1983. P. 75–76.
Petch T. Studies in entomogenous fungi. VI. Cephalosporium and associated fungi // Transactions of the British Mycological Society.1925. Vol. 10, N 3. P. 152–182.
Ronquist F., Huelsenbeck J. P. MrBayes version 3.0: Bayesian phylogenetic inference under mixed models. Bioinformatics. 2003. Vol. 19, N 12. P. 1572–1574.
Sung G.-H., Sung J.-M., Hywel-Jones N. L., Spatafora J. W. A multigene phylogeny of Clavicipitaceae (Ascomycota, Fungi): identification of localized incongruence using a combinational bootstrap approach // Molecular Phylogenetics and Evolution. 2007. Vol. 44. P. 1204–1223.
Vandermeer J., Perfecto I., Liere H. Evidence for hyperparasitism of coffee rust (Hemileia vastatrix) by the entomogenous fungus, Lecanicillium lecanii, through a complex ecological web // Plant Patholology. 2009. Vol. 58. P. 636–641.
Verhaar MA, Kerssies A, Hijwegen T. 1999. Effect of relative humidity on mycoparasitism of rose powdery mildew with and without treatments with mycoparasites // Zeitschrift fuer Pflanzenkrankheiten und Pflanzenschutz. Vol. 106. P. 158 – 165.
Zare R., Gams W. A revision of Verticillium section Prostrata. IV. The genera Lecanicillium and Simplicillium gen. nov. // Nova Hedwigia. 2001. Vol.73. P. 1–50.
Zare R., Gams W., Culham A. A revision of Verticillium sect. Prostrata. I. Phylogenetic studies using ITS sequences // Nova Hedwigia. 2000. Vol.71. P. 465–480.
Avanesov S. G. The biological basis of the selection of the virulent strains of the entomopathogenic fungi Verticillium lecanii (Zimm.).1987. 19 p. (in Russian).
Borisov B. A. The problems of creation and using of mycoinsecticidal preparations / The study of entomopathogenic microorganisms and development of technologies for their production and use. Romania. Bucharest. 1990. P. 8-22.
Таблица 1.
Список рабочей коллекции штаммов энтомопатогенных грибов рода Lecanicillium и Lecanicillium - подобных грибов
Штамм | Хозяин, источник выделения | Географическое происхождение | Год выде-ления | Видовая принадлежность по сиквенсу NAD1 | Гаплотип L. muscarium |
Vl 2 | Половая стадия гриба Torrubiella arachnophila (Johnst.) Mains на пауке Aranei | Центральная Россия, Московская обл. | 1985 | L. muscarium | A |
Vl 3 | оранжерейная белокрылка T. vaporariorum (Homoptera: Aleyrodidae) | Молдавия, Кишинев | 1982 | L. muscarium | B |
Vl 4 | оранжерейная белокрылка T. vaporariorum (Homoptera: Aleyrodidae) | Восточная Сибирь, Иркутск | 1982 | L. muscarium | A |
Vl 5 | ежевичная белокрылка Pealius setosus (Homoptera: Aleyrodidae) | Юго-Западная Грузия, Аджария | 1982 | L. muscarium | C |
Vl 8 | цикада Evacanthus interruptus (Homoptera: Cicadellidae) | Центральная Россия, Смоленск | 1985 | L. muscarium | A |
Vl 9 | оранжерейная белокрылка T. vaporariorum (Homoptera: Aleyrodidae) | Центральная Россия, Московская область, Раменское | 1985 | L. muscarium | B |
Vl 11 | оранжерейная белокрылка T. vaporariorum (Homoptera: Aleyrodidae) | 1984 | L. muscarium | D | |
Vl 13 | Неизвестно | Англия | - | L. longisporum | - |
Vl 15 | Неизвестно | неизвестно | - | L. muscarium | D |
Vl 18 | оранжерейная белокрылка T. vaporariorum (Homoptera: Aleyrodidae) | Центральная Россия, Московская область, Раменское | 1985 | L. muscarium | B |
Vl 21 | оранжерейная белокрылка T. vaporariorum (Homoptera: Aleyrodidae) | 1981 | L. muscarium | B | |
Vl 22 | большая картофельная тля Aulacorthum solani (Homoptera: Aphididae) | 1985 | L. muscarium | B | |
Vl 23 | Жимолостная белокрылка (Homoptera: Aleyrodidae) | Центральная Россия, Москва | 1984 | L. muscarium | A |
Vl 24 | медяница (Homoptera: Psyllodea) | 1984 | L. muscarium | A | |
Vl 27 | тля (Homoptera: Aphididae) | 1983 | L. muscarium | B | |
Vl 29 | Жимолостная белокрылка (Homoptera: Aleyrodidae) | Юго-Западная Грузия, Аджария | 1985 | L. muscarium | C |
Vl 34 | ежевичная белокрылка Pealius setosus (Homoptera: Aleyrodidae) | 1985 | L. muscarium | A | |
Vl 35 | грушевая тля Dysaphis pyri (Homoptera: Aphididae) | Украина, Херсон | 1985 | L. muscarium | A |
Vl 40 | оранжерейная белокрылка T. vaporariorum (Homoptera: Aleyrodidae) | Камчатка | 1982 | L. muscarium | D |
Vl 42 | муха Diptera | Центральная Россия, Московская область | 1982 | L. muscarium | A |
Vl 47 | Половая стадия гриба Torrubiella arachnophila (Johnst.) Mains на пауке Aranei | Центральная Россия, Смоленск | 1985 | L. muscarium | A |
Vl 48 | Homoptera: Aleyrodidae | Центральная Россия, Московская область | 1984 | L. muscarium | A |
Vl 49 | оранжерейная белокрылка T. vaporariorum (Homoptera: Aleyrodidae) | Центральная Россия, Марий-Эл, Йошкар-Ола | 1981 | L. muscarium | D |
Vl 50 | Половая стадия гриба Torrubiella arachnophila (Johnst.) Mains на пауке Aranei | Центральная Россия, Москва | 1987 | L. muscarium | A |
Vl 55 | червец Ortezia urticae (Homoptera: Coccidae) | Центральная Россия, Московская область, Раменское | 2000 | L. muscarium | B |
Vl 56 | урединиопустулы возбудителя ржавчины Phragmidium sp. на Salix | 2000 | L. muscarium | B | |
Vl 57 | урединиопустулы возбудителя ржавчины Phragmidium sp. на Salix | 2000 | L. muscarium | A | |
Vl 58 | Жимолостная белокрылка (Homoptera: Aleyrodidae) | 2000 | L. muscarium | A | |
Vl 59 | оранжерейная белокрылка T. vaporariorum (Homoptera: Aleyrodidae) | Центральная Россия, Московская область, Люберцы | 2000 | L. muscarium | C |
Vl 60 | тля (Homoptera: Aphididae) | Юг России, Краснодарский край, Мостовской район | 2000 | L. muscarium | C |
Vl 61 | урединиопустулы возбудителя ржавчины Phragmidium sp. на Rubus sp. | Юг России, Краснодарский край, Мостовской район | 2000 | L. muscarium | C |
Vl 62 | горная почва | Юг России, Карачаево-Черкесия, Теберда | 2000 | L. muscarium | A |
Vl 65 | белокрылка (Homoptera: Aleyrodidae) | Юг России, Краснодарский край, Сочи | 2000 | L. muscarium | B |
Vl 68 | белокрылка Aleurodes lonicerae (Homoptera: Aleyrodidae) | Центральная Россия, Московская область, Раменское | 2002 | L. muscarium | A |
Vl 72 | белокрылка Aleurodes lonicerae (Homoptera: Aleyrodidae) | Центральная Россия, Московская область, Долгопрудный | 1999 | L. muscarium | A |
Vl 76 | белокрылка (Homoptera: Aleyrodidae) | Молдавия, Кишинев | - | L. muscarium | A |
Vl 77 | божья коровка Coccinellidae | Греция, о. Кипр, Троодос, г. Олимп | 2012 | Сходство с L. muscarium (изолят C42) на 97% | - |
Vl 78 | неидентифицированное насекомое | Греция, о. Кипр, Протарас | 2012 | L. psalliotae | - |
Vl 79 | почва водопада | Греция, о. Кипр, Троодос | 2012 | L. psalliotae | - |
Подписи к рисункам к статье и соавторов
Рис.1. Филограмма, построенная на основании сравнения нуклеотидных последовательностей гена nad1 штаммов Lecanicillium spp. методом байесовского заключения для 1000000 поколений (стандартное отклонение расщепленных частот 0.006). Гаплотипы Lecancillium muscarium и штаммы других видов, сиквенсы для которых получены в настоящей работе, выделены полужирным шрифтом; для четырех гаплотипов L. muscarium перечислены все проанализированные штаммы. Для референтных штаммов приведены номера доступа в Генбанке. В качестве внешней группы выбран Metarhizium anisopliae.
