Множественность понятия «хитозан» и терминология в области хитина и хитозана
Институт элементоорганических соединений имени РАН, Москва, E-mail: *****@***ac. ru
Из сборника «ХИТОЗАН», ред. , , Москва, Центр «Биоинженерия» РАН, 2013. 49-60, ISBN 978-5-4253-0596-1.
DEFINITION OF TERMS RELATING TO CHITIN AND CHITOSAN
V. E. Tikhonov
A. N. Nesmeyanov Institute of Organoelement Compounds, Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia. E-mail: *****@***ac. ru
Abstract
This report has been prepared to present clear concepts and definitions of general and specific terms with regards to chitin, chitosan and their derivatives. Current concepts of polymer chemistry and physics (monomer, oligomer, polymer, persistence length, Kuhn segment) have been used to define terms: chitin, chitosan, oligochitosan, chitooligomer, and the mixture of chitooligomers, in accordance with IUPAC Compendium of Chemical Terminology and definitions arisen from the polymeric nature of chitosan.
За последние десятилетия такие термины как: хитин, нативный хитин, хитозан, хитоолигосахариды, олигомеры хитозана, олигосахариды хитозана, олигосахариды хитина, водорастворимые олигомеры хитозана, олигоглюкозамин, олигохитозан, гетерохитозаны, смесь хитоолигосахаридов, деградированный хитозан, низкомолекулярный хитозан и водорастворимый низкомолекулярный хитозан нашли достаточно широкое применение в научной литературе.
Термины «хитин» и «хитозан» являются наиболее часто используемыми среди вышеуказанных терминов и относятся к полисахаридам, состоящим из N-ацетилглюкозамина или/и глюкозамина. Мы можем назвать «нативным хитином» полимер, который содержится в экзоскелете ракообразных, насекомых и в клеточных стенках некоторых грибов. Для более конкретного описания веществ, получаемых из нативного хитина, следует предварительно вернуться к понятиям и терминологии, утвержденным Международным союзом по чистой и прикладной химии (IUPAC Compendium of Chemical Terminology [1] ):
1. мономеры - это низкомолекулярные вещества, молекулы которых способны вступать в реакцию (полимеризации или поликонденсации) друг с другом или с молекулами других веществ с образованием олигомера или полимера.
Олигомер и полимер состоят из мономерных звеньев - повторяющихся элементов полимерной цепи. В хитине и хитозане – N-ацетилглюкозаминные и глюкозаминные фрагменты.
2. олигомеры, члены гомологических рядов, занимающие по размеру молекул область между мономерами и высокомолекулярными соединениями. Верхний предел молярных масс олигомеров зависит от их химической природы и соответствует тому значению, при котором начинают проявляться высокоэластические деформации и другие свойства, характерные для высокомолекулярных веществ – полимеров. В первую очередь, способность молекулы сворачиваться в клубок.
Олигомеры и полимеры, полученные полимеризацией (поликонденсацией и т. д.) всегда состоят из множества молекул разной длины (степени полимеризации). Следует отметить, что олигомеры могут быть подразделены на низшие и высшие олигомеры. К низшим олигомерам относятся димеры, тримеры, тетрамеры, пентамеры и т. д., если они, соответственно, состоят из 2, 3, 4, 5 и более мономерных звеньев. Низшие олигомеры могут быть получены прямым химическим или ферментативным синтезом. Как правило, низшие олигомеры получают в виде индивидуальных веществ, по свойствам отличающихся от высших олигомеров, которые, в свою очередь, редко могут быть или были выделены в индивидуальной форме. Так, олигосахаридами иногда называют сложные углеводы, построенные 3-10 остатков моносахаридов, исключая по непонятной причине, дисахариды. Высшие представители олигомеров, как правило, получаются в виде смесей установленного или чаще неустановленного состава и характеризуются определенным молекулярно-массовым распределением. В присутствии растворителя или в конденсированной фазе высшие олигомеры, в отличие от низших олигомеров, склонны к образованию достаточно термодинамически устойчивых надмолекулярных структур - агрегатов и агломератов, тогда как низшие олигомеры более склонны к образованию кристаллов и неустойчивых ассоциатов. Граница между низшими и высшими олигомерами достаточно условна, но для каждого ряда олигомеров может быть условно проведена по структурно охарактеризованному олигомеру с наибольшим числом мономерных звеньев. В случае хитина и хитозана эту границу по додекамеру, т. е. хитододекасахариду – крайнему представителю выделенных и охарактеризованных хитоолигосахаридов со степенью полимеризации n=12 и молекулярной массой около 2 кДа.
3. Полимер – это вещество, состоящее из молекул большой молекулярной массы, которые, в свою очередь, состоят из повторяющихся структурных единиц - мономерых звеньев, связанных ковалентными химическими связями. Полимеры представляют собой те члены гомологических рядов, которые обладают характерными свойствами высокомолекулярных соединений, такими как способностью к высокоэластической деформации, образованию пленок и анизотропных волокнистых структур, способностью к набуханию и образованию высоковязких растворов. Эти свойства обнаруживают только у высокомолекулярных соединений, построенных из линейных или умеренно разветвленных макромолекул. Характерные свойства полимеров обусловлены большой длиной и гибкостью цепей макромолекул, их способностью изменять свою конформацию за счет вращения образующих цепь мономерных звеньев относительно ординарных химических связей с сохранением валентных углов.
Мерой гибкости цепных макромолекул является так называемая величина сегмента макромолекулы (сегмент Куна), под которым понимают такое максимальное значение длины цепи, которую должны были бы иметь макромолекулы для того, чтобы вещество все еще подчинялось бы обычным для низкомолекулярного соединения термодинамическим закономерностям (закон Вант-Гоффа, Рауля и т. д.). Чем гибче макромолекула, тем более независимо движутся ее отдельные части, и тем большему количеству малых молекул эквивалентна она в своих движениях, т. е. тем меньше размер ее сегмента. Величины сегментов макромолекул, определенные из различных термодинамических данных (по осмотическому давлению, упругости пара растворителя над раствором полимера и т. д.) теоретически должны быть одинаковыми, однако практически они могут не совпадать между собой, что свидетельствует лишь о реальном существовании макромолекул, а не сегментов макромолекул.
Способность макромолекулы (в том числе и макромолекулы хитозана) к образованию статистического клубка является непосредственным проявлением термодинамичической гибкости, а размеры клубка служат количественной характеристикой этой гибкости. При этом моделью макромолекулы служит эквивалентная цепь, состоящая из статистических сегментов, абсолютно свободно вращающихся друг относительно друга.
Величина сегмента пропорциональна такому числу звеньев в сегменте n, при котором полностью утрачивается корреляция между направлениями первого и n-го звеньев сегмента. Поскольку в реальных полимерах длина (размер) мономерных звеньев может варьировать в широких пределах, степень полимеризации сегмента Куна n является более информативной мерой гибкости, чем персистентная длина. Персистентная длина определяется как такая минимальная длина цепи, при превышении которой теряется корреляция направления оси каждого последующего звена цепи и осью первого мономерного звена цепи линейного полимера. На основании оценок величины n линейные полимеры относят к гибкоцепным, полужестким или жесткоцепным. Гибкоцепными полимерами принято считать те, у которых n не превышает 15. Условная граница между гибкоцепными и полужесткими макромолекулами лежит в области n ~ 15-20.
В статистической теории цепных макромолекул, цепная макромолекула представляется как система соединенных между собой по концам гипотетических сегментов, обладающая определенной гибкостью за счет вращения вокруг ординарных химических связей. Эта характеристика гибкости макромолекул основана на графическом анализе проекции полимерной цепи, образующей на плоскости линию, в которой проекция вектора каждого последующего звена совпадает с вектором первого звена. В конформационной статистике полимерных макромолекул под сегментом макромолекулы понимают ту минимальную длину участка цепной макромолекулы, при которой полностью теряется корреляция между движениями первого и последнего удаленных друг от друга мономерных звеньев участка цепи, т. е. длина сегмента Куна – это такая минимальная длина гипотетического сегмента, при котором вся цепь может быть представлена как свободно сочлененная цепь, пространственное расположение концов которой независимо друг от друга.
Рассмотрим возможные конформации гипотетической макромолекулы в простейшем случае, т. е. когда макромолекула представляет собой свободно-сочлененную цепь с фиксированными валентными углами и свободным внутренним вращением [2-5]. Без использования математического аппарата и для наглядности объяснения на рисунке изображена проекция на плоскость гипотетического участка полужесткой макромолекулы, состоящей из одинаковых звеньев a—b, соединенных ординарной связью под углом 450. Вращение вокруг ординарной связи создает возможность нахождения следующего звена b—a, как выше, так и ниже оси первого звена и т. д. На рисунке показаны персистентная длина, изображенная как минимальный участок цепи, в котором проекция вектора каждого последующего звена совпадает с вектором первого звена, и сегмент Куна, изображенный как минимальный участок цепи, при котором положение первой и конечной точки участка совпадают. Для полужестких полимеров, таких как хитозан, персистентная длина (4 участка a—b) составляет половину сегмент Куна (8 участков a—b). Для более жестких полимеров угол вращения (например: 300) вокруг связи a—b меньше.
Соответственно увеличиваются персистентная длина и соотношение между сегментом Куна и персистентной длиной (1:3). В случае более гибкого полимера (угол вращения вокруг связи a—b больше) уменьшается персистентная длина и соотношение между сегментом Куна и персистентной длиной.
Таким образом, граница между олигомером и полимером определяется минимальным молекулярным весом, при котором начинают проявляться характерные признаки полимера, отличающие его от олигомера, т. е. при длине цепи, превышающей сегмент Куна (величина сегмента Куна – это верхняя граница длины цепи олигомера и нижняя граница длины цепи (молекулярной массы) полимера). Однако, величина персистентной длины, определенная из термодинамических данных и по результатам гидродинамического поведения растворов хитина и хитозана могут отличаться значительно. Так на результаты, получаемые методом эксклюзионной хроматографии, влияют гидродинамические размеры молекул хитозана и гидрофильно-гидрофобные и ионные взаимодействия между молекулами хитозана и полимерным хроматографическим материалом, заполняющим колонку. На результаты, определяемые по светорассеянию, оказывают влияние, как агрегационные эффекты, так и наличие сильно набухших нерастворимых частиц хитина и хитозана даже после тщательной фильтрации их растворов. Также на результаты оказывает влияние степень ацетилирования и характер (блочный или статистический) распределения ацетильных групп по цепи молекул хитозана, а также рН и ионная сила раствора.
Полидисперсность является еще одной характеристикой хитозана как полимера. Полидисперсность является мерой различия молекулярных масс макромолекул в образце полимера. В научной литературе полидисперсность выражается в виде индекса полидисперсности (Ip), который математически определяется как отношение средневесового молекулярного веса (Mw) к среднечисловому молекулярному весу (Mn): Ip = Mw/Mn. Всегда Ip≥1.Чем меньше величина Ip, тем меньше молекулы различаются по молекулярному весу. Вещество, состоящее из одинаковых по молекулярной массе молекул, имеет Ip=1. Таким образом, понятие «хитозан» описывает полимер, растворимый в разбавленных водой кислотах и существующий в виде смеси макромолекул, различающихся по молекулярному весу и степени дезацетилирования. К сожалению, достаточно часто в научной литературе, а также при описании практического использования хитозана в той или иной области понятие «хитозан» применяется без указания его основных характеристик: молекулярного веса, степени дезацетилирования и полидисперсности, что не позволяет сравнивать те или иные свойства хитозанов, полученных разными способами и исследователями.
Теперь вернемся к хитину и хитозану. Понятие «хитин» относится к биополимеру, выделенному из биологического сырья, и используется главным образом для гомополимера, построенного из молекул N-ацетил-D-глюкозамина, соединенных по в-1,4 связям, хотя хитин может содержать и N-дезацетилированные фрагменты, т. е. быть гетерополимером N-ацетил-D-глюкозамина и D-глюкозамина, а также остатки белковых компонентов нативного хитина. Хитин, выделенный из природного источника, может иметь молекулярный вес более миллиона дальтон, хотя способ и условия его выделения сильно сказываются на молекулярной массе получаемого продукта.
Хитин и продукт его дезацетилирования могут быть охарактеризованы молекулярным весом (Mw, Mn), степенью дезацетилирования (СД) или степенью ацетилирования (СА). Степень дезацетилирования показывает относительное мольное содержание аминогрупп в полимере. Степень ацетилирования показывает относительное мольное содержание N-ацетильных групп. Условия дезацетилирования хитина очень сильно сказываются как на степени дезацетилирования, так и на молекулярной массе получаемого продукта, а также на распределении ацетильных групп по цепи полимера. При достижении определенной степени дезацетилирования полученный продукт становится растворимым в разбавленных водой кислотах (например, уксусной и соляной). Такая растворимая в разбавленных кислотах форма хитина получила название «хитозан». Обычно хитозан имеет СД ≥ 60%. Когда полимер содержит менее 40% ацетильных групп (СА≤40), то перед нами «хитозан», который можно назвать хитином со СД более 60%. Однако в научной литературе имеются сведения о возможности получения хитина со степенью дезацетилирования ~ 50%, растворимого в водных растворах. Хитин (СД~50%) подобен хитозану со степенью ацетилирования СА~50%, но отличается тем, что такой хитин получают контролируемым ацетилированием хитозана в растворе, что приводит к более равномерному распределению ацетильных групп по полимерной цепи и, как следствие, к тому, что продукт становится растворимым в водных растворах, даже не содержащих добавок кислот. Тем не менее, несмотря на указанное различие, растворимость в разбавленных кислотах следует считать практическим критерием различия между хитином и хитозаном.
Таким образом, говоря о хитозане, мы должны упоминать его основные характеристики: молекулярный вес и степень дезацетилирования, поскольку понятие «хитозан» не является химическим термином в прямом смысле, а является лишь общим именем сообщества сополимеров N-ацетилглюкозамина и глюкозамина, различающихся составом и молекулярным весом.
Остальная терминология в области хитина и хитозана представляется несколько запутанной. Понятия «низкомолекулярный хитозан», «олигохитозан» и «деградированный хитозан» обычно используется для описания частично или достаточно глубоко деполимеризованного тем или иным способом хитозана, т. е. хитозана, с относительно пониженной молекулярной массой и, как следствие, при растворении которого образуются растворы с относительно пониженной вязкостью.
Термин «низкомолекулярный хитозан» часто используют наравне с термином «олигохитозан». Термин «хитоолигосахариды» (или «хитоолигомеры») чаще относят к группе водорастворимых олигомеров ацетилглюкозамина и/или глюкозамина определенного или неопределенного строения, имеющих степень полимеризации (n) 2≤n≤12. Однако в научной литературе этот термин используют и наравне с терминами «олигомеры хитозана», «олигосахариды хитозана», «олигосахариды хитина», «хитоолигомеры», «водорастворимые олигомеры хитозана», «олигоглюкозамин», «гетерохитозаны», «смесь хитоолигосахаридов». Отмечены случаи использования термина «хитозан» к продуктам, полученным деполимеризацией хитозана, с молекулярной массой 1,2-30,0 кДа, а термина «смесь хитоолигосахаридов» - к смеси продуктов деполимеризации хитозана с молекулярной массой 2-30 кДа. Термин «олигохитозан» был использован даже для смеси низших олигомеров со степенью полимеризации n=3-9.
Смесь хитоолигосахаридов получают глубокой, но не полной, деполимеризацией хитозана в сильнокислой среде при повышенной температуре. Контролируемый энзиматический и химический гидролиз этих полимеров также используются в процессах получения смесей хитоолигосахаридов. Выделение индивидуальных олигомеров представляет собой трудоемкий процесс, включающий одну или несколько хроматографических стадий. К настоящему времени были выделены и охарактеризованы только низшие олигомеры со степенью полимеризации не более двенадцати. Растворы низших хитоолигомеров, как индивидуальных, так и их смеси, имеют очень низкую, близкую к воде, вязкость. Низшие представители хитоолигосахаридов (n=2-12) были получены в виде индивидуальных соединений и охарактеризованы методами ИК и ЯМР спектроскопии и масс-спектрометрии. Ряд высших представителей хитоолигосахаридов (n≤20) были охарактеризованы по молекулярной массе (масс-спектрометрия), методами ИК и ЯМР спектроскопии и ГПХ. Смеси высших хитоолигосахаридов (т. е. олигохитозан) характеризуются методами ЯМР, вискозиметрии и ГПХ.
Частичная деполимеризация хитозана происходит уже в процессе длительного дезацетилирования хитина при высоких температурах (120-1400С) в концентрированных растворах NaOH (30-100 % вес./об.). Другим способом частичной деполимеризации хитозана является использование специфических (хитиназа, хитозаназа) и неспецифических ферментов (лизоцим, амилаза, целлюлаза, липаза, протеаза и др.), микроволновая обработка растворов хитозана.
В настоящее время имеются несколько основных способов глубокой деполимеризации хитозана: кислотный и ферментативный гидролиз, окислительная деполимеризация с помощью перекиси водорода, периодной кислоты (периодата натрия) или азотистой кислоты (нитрита натрия), а также их различные модификации. Все эти методы имеют свои достоинства и недостатки. Кислотный гидролиз требует использования избытка сильной кислоты (как правило, соляной кислоты) и последующей ее регенерации или нейтрализации. Ферментативный гидролиз требует использования больших количеств дорогих, чистых ферментов или более дешевых ферментных комплексов, а также последующей очистки продукта гидролиза от используемых ферментов и примесных белков. Окислительная деполимеризация хитозана протекает значительно быстрее, чем кислотный и, тем более, ферментативный гидролиз, однако приводит к изменению химической структуры хитозана (частичное дезаминирование и окисление) тем в большей степени, чем глубже степень деполимеризации. К сожалению, в процессе химической деполимеризации молекулы хитозана подвергаются зачастую и химической модификации, приводящей к появлению карбоксильных групп, альдегидных групп, дезаминированию, образованию шиффовых оснований, количества которых определяются и зависят от использованных методов выделения и деполимеризации хитозана [6-21].
Выбор конкретного способа деполимеризации хитозана определяется свойствами требуемого продукта и условиями его конкретного применения. Однако всегда следует принимать во внимание, что неоднородность деполимеризованного хитозана на молекулярном уровне является причиной различия его физико-химических и биологических свойств.
Многочисленные исследования антимикробной активности хитозана, проведенные к настоящему времени, показали, что активность сильно зависит от молекулярной массы хитозана, содержания ацетильных групп (степени дезацетилирования) и экспериментальных условий. Различия в антимикробной активности образцов хитозана, полученных различными методами, связаны с различием в молекулярной массе, степени дезацетилирования, распределения ацетильный групп по молекулярным цепям хитозана, присутствия различного типа и количества низших и высших хитоолигосахаридов (т. е. полидисперстности конкретного образца), а также присутствием побочных продуктов, образующихся при деполимеризации хитозана. Все эти факторы определяют структурную неоднородность хитозана и его производных, которая является следствием предыстории получения конкретного образца.
Для смесей низших хитоолигосахаридов, полученных глубокой деполимеризацией хитозана, также иногда используют термин «олигоглюкозамин». Хитоолигосахариды (хитоолигомеры), имеющие степень полимеризации более восьми, нерастворимы в воде, хотя и очень легко растворяются в разбавленных водой кислотах с образованием растворов очень низкой вязкости. Для них чаще часто используют термины «олигохитозан», и «водорастворимый низкомолекулярный хитозан», или просто «низкомолекулярный хитозан».
Таким образом, в настоящее время в научной литературе используется достаточно запутанная система терминов, относящихся к олигомерам N-ацетилглюкозамина и глюкозамина, хитину и хитозану.
На наш взгляд, следующее мнение может быть принято во внимание для различия между олигохитозаном и низкомолекулярным хитозаном, и это мнение базируется на полимерной природе хитозана и терминологии, утвержденной IUPAC.
Для хитозана, как и для всякого линейного полимера, применимо понятие персистентной длины и сегмента Куна. Персистентная длина и сегмент Куна характеризуют жесткость полимерных молекул хитозана, их способность принимать различные стерические формы. Для хитозана, как полиэлектролита, используется понятие эффективной персистентной длины, которая увеличивается вследствие электростатического отталкивания между одноименными зарядами, распределенными по цепи полимера, и определяется как сумма характеристической персистентной длины при нулевом заряде цепи и электростатической персистентной длины.
В результате определения различными методами величины персистентной длины молекул хитина и хитозана было показано, что молекулы хитина являются более жесткими, чем молекулы хитозана, так что персистентная длина постепенно увеличивается с увеличением степени N-ацетилирования. На экспериментально определяемую величину персистентной длины сильно влияют СД хитозана и ионная сила его раствора, поскольку персистентная длина является характеристикой локальной жесткости полимера и определяет гидродинамические свойства раствора хитозана: чем больше персистентная длина, тем больше вязкость раствора полимера с данной молекулярной массой. Уменьшение персистентной длины при увеличении ионной силы раствора указывает на то, что цепи молекул хитозана становятся более гибкими, когда ослабевают силы отталкивания между одноименными зарядами. В случае хитозана от степенью ацетилирования от 7 мол.% до 40 мол.% и низкой или умеренной ионной силы раствора персистентная длина, определенная экспериментально различными методами для различных образцов хитозана, уменьшается с 81 нм до 32 нм с увеличением ионной силы раствора с I=0,009М до I=0,46М, и достигает расчетной величины 24нм при I→ ∞, т. е. в и-условиях (т. е., когда отсутствуют специфические взаимодействия между молекулами полимера и между молекулами полимера и молекулами растворителя). Следовательно, максимальная величина сегмента Куна молекул хитозана, наиболее часто используемого в научных и практических целях, составляет 480Ао. Таким образом, максимальная величина молекулярной массы олигохитозана (Mw), рассчитанная по формуле: Mw = 2L(intrinsic)·ML [где: 2L – величина сегмента Куна, L(intrinsic) - характеристическая персистентная длина, ML = 33,4 Да/Ао – средняя величина молекулярного веса звена молекулы хитозана со степенью ацетилирования 15-40 мол.%, приходящаяся на единицу длины проекции макромолекулы на плоскость], составляет
Mw ~16 кДа, что соответствует средней степени полимеризации сегмента Куна n ~100 [6, 22-31].
На основании вышеизложенного может быть предложена следующая терминология:
Мономер хитина и хитозана – это индивидуальные N-ацетилглюкозамин и глюкозамин, соответственно, в соответствии с правилами IUPAC.
Хитоолигомеры – это низшие олигомеры хитина и хитозана с неустановленным распределением ацетильных групп и молекулярной массой до 2 кДа. В случае установленного распределения ацетильных групп (крайне редко встречающийся случай в химии хитозана) название соответствующего соединения должно составляться согласно общим номенклатурным правилам, рекомендованных Международным союзом по чистой и прикладной химии. Например, N, N12-диацетилхитододекамер. Понятие «смесь хитоолигомеров» следует использовать для смеси хитоолигомеров неустановленного состава.
Олигохитозан - это высшие хитоолигомеры и их смеси с молекулярной массой от 2 кДа до 16 кДа.
Хитозан – это гомополимер глюкозамина (при степени ацетилирования равной нулю) или гетерополимер ацетилглюкозамина и глюкозамина с содержанием N-ацетильных групп больше нуля, растворимый в разбавленных кислотах, с молекулярной массой более 16 кДа. Использование понятия «низкомолекулярный хитозан» следует избегать или использовать его только для частично деполимеризованного хитозана, т. е. хитозана с относительно пониженной молекулярной массой, и обязательным ее указанием.
Хитин – это гомополимер N-ацетилглюкозамина или гетерополимер ацетилглюкозамина и глюкозамина, нерастворимый в разбавленный кислотах.
Во всех случаях, кроме мономеров и индивидуальных низших олигомеров, следует указывать среднюю степень ацетилирования, молекулярную массу и метод ее определения и полидисперсность.
Литература
Jenkins A. D., Kratochvil P., Stepto R. F.T., Suter U. W. 1996. Glossary of Basic Terms in Polymer Science (IUPAC Recommendations 1996). Pure Appl. Chem. 68, 2287─2311. Kuhn W. 1934. Ьber die Gestalt fadenfцrmiger Molekьle in Lцsungen. Kolloid Zeitschrift 68, 2─15. Kuhn W. 1939. Molekьlkonstellation und Kristallitorientierung als Ursachen kautschukдhnlicher Elastizitдt. Kolloid Zeitschrift 3, 3─12. Flory, P. J. 1989. Statistical Mechanics of Chain Molecules, Wiley, ISBN 1-56990-019-1. Orr W. J.C. 1947. Statistical treatment of polymer solutions at infinite dilution. Trans. Faraday Soc. 43, 12─27. Aam B. B., Heggset E. B., Norberg A. L., Sшrlie M., Vеrum K. M., Eijsink V. G.H. 2010, Production of chitooligosaccharides and their potential application in medicine. Mar. Drugs 8, 1482─1517. Mourya V. K., Inamdаг N. N., Choudhaгi Y. M. 2011. Chitooligosaccharades: synthesis, characterization and applications. Polymer Science A53, 1059─1089. S. K. Kim S. K., N. Rajapakse N. 2005. Enzymatic production and biological activities of chitosan oligosaccharides (COS): A review. Carbohydrate Polymers 62, 357─ 368. Ilyina A. V., Tikhonov V. E., Albulov A. I., Varlamov V. P. 2000. Enzymatic preparation of acid-free-water soluble chitosan. Process Biochem. 35, 563─568. Lin S.-B., Lin Y.-C, Chen H.-H. 2009. Low molecular weight chitosan prepared with the aid of cellulose, lysozyme and chitinase: characterization and antibacterial activity., Food Chem. 116, 47─53. Tian F., Liu Y., Hu K., Zhao B. 2004. Study of the depolymerization behavior of chitosan by hydrogen peroxide. Carbohydrate Polymers 57, 31─37. Qin C. Q., Du Y. M., Xiao L. 2002. Effect of hydrogen peroxide treatment on the molecular weight and structure of chitosan. Polym. Degrad. Stab. 76, 211─218. Allan G. G., Peyron M. 1995. Molecular weight manipulation of chitosan II: prediction and control of extent of depolymerization by nitrous acid. Carbohydr. Res. 277, 273─ 282. Tшmmeraas K., Vеrum K. W., Christensen B. E., Smidsrшd O. 2007. Preparation and characterization of oligosaccharides produced by nitrous acid depolymerization of chitosan. Carbohydr. Res. 333, 137─144. Vold I. M.N, Christensen B. E. 2005. Periodate oxidation of chitosans with different chemical compositions. Carbohydr. Res. 340, 679─684. Vеrum K. W., Ottшy M. H., Smidsrшd O. 2001. Acid hydrolysis of chitosan. Carbohydrate Polymers 46, 89─98. Einbu A., Grasdalen H., Vеrum K. W. 2007. Kinetics of hydrolysis of chitin/chitosan oligomers in concentrated hydrochloric acid. Carbohydr. Res. 342, 1055─1062. Einbu A., Vеrum K. W. 2007. Depolymerization and de-N-acetylation of chitin oligomers in hydrochloric acid. Biomacromolecules 8, 309─314. Blagodatskikh I. V., Bezrodnikh E. A., Abramchuk S. A., Muranov A. V., Sinitsyna O. V., Khokhlov A. R., Tikhonov V. E. 2013. Short chain chitosan solutions: self-assembly and aggregates disruption effects. J. Polym. Res. 20, DOI: 10.1007/s10965-013-0073-0. Kulikov S., Tikhonov V., Blagodatskikh I., Bezrodnykh E., Lopatin S., Khairullin R., Philippova Y., Abramchuk S. 2012. Molecular weight and pH aspects of the efficacy of oligochitosan against meticillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Carbohydrate Polymers 87, 545─550. Tikhonov V., Stepnova E., Lopatin S., Varlamov V., Il’yina A., Yamskov I. 2011. The unusual bell-like dependence of the activity of chitosan against Penicillium vermoesenii on chitosan molecular weight. In: Chitosan: Manufacture, Properties, and Usage/Biotechnology in Agriculture, Industry and Medicine, Ed. S. P. Davis, Nova Science Publishers, Inc., Chapter 17, pp.315-326, ISBN: 978-1-61122-042-1 2011. Rogovina N. V., Yevlampieva N. P., Khrustalev A. Z., Marsheva V. N., Marchenko G. N., Tsvetkov V. N. 1986. Flow birefringence in solutions of chitosan. Polymer Science USSR 28, 251─259. Terbojevich M., Carraro C., Cosani A. 1988. Solution studies of the chitin-lithium chloride-N, N,dimethylacetamide system. Carbohydr. Res. 180, 73─86. Rinaudo M., Domard A. 1989. Solution properties of chitosan. In: Chitin and Chitosan, G. Skjеk-Braek, T. Anthonsen, P. Sandford (eds.), Elsevier Applied Science, London, pp.71─86. Terbojevich M., Cosani A., Como G., Marsano E., Bianchi E. 1991. Chitosan: chain rigidity and mesophase formation. Carbohydr. Res. 209, 251─260. Anthonsen M. W., Vеrum K. M., Smdstrшd O. 1993. Solution properties of chitosans: Conformation and chain stiffness of chitosans with different degrees of N-acetylation. Carbohydrate Polymers 22, 193─201. Ullner M., Jхnsson B., Peterson C., Sommelius O., Sхderberg B. 1997. The electrostatic persistence length calculated from Monte Carlo, variation and perturbation methods J. Chem. Phys. 107, 1279─1287. Brugnerotto J., Desbrieres J., Roberts G., Rinaudo M. 2001. Characterization of chitosan by steric exclusion chromatography. Polymer 42, 9921─9927. Cho J., Heuzey M-C., Bйgin A., Carreau P. J. 2006, Viscoelastic properties of chitosan solutions: Effect of concentration and ionic strength. J. Food Eng. 74, 500─515. Rinaudo M. 2006. Chitin and chitosan: Properties and applications. Prog. Polym. Sci. 31, 603─632. Pillai C. K.S., Paul W., Sharma C. P. 2009. Chitin and chitosan polymers: chemistry, solubility and fiber formation. Prog. Polym. Sci. 34, 641─678.