УДК 66.091.2
Разработка методики количественного определения суммы флавоноидов в цветах календулы лекарственной различных сортов
© 1*+, 1,
2 и 2
1Кафедра органической химии и химии красителей. Московский государственный текстильный университет имени , , г. Москва, ГСП-1, 119071, Россия
Тел.: (495)955-35-48, E-mail: *****@***ru
2 Кафедра виноградарства и виноделия РГАУ-МСХА имени , , корпус № 17, г. Москва, 127550, Россия
Тел.: (499) 976-4906, E-mail: *****@***ru
___________________________________________
*Ведущий направление; +Поддерживающий переписку
Ключевые слова: определения суммы флавоноидов, календула лекарственная, Calendula officinalis, природные красители.
Аннотация
В работе описана методика определения суммы флавоноидов цветов календулы лекарственной по рутину, основанная на батохромном сдвиге максимума поглощения в УФ-спектре экстракта при комплексообразовании флавоноидов с солями алюминия.
Введение.
Календула лекарственная или ноготки (Calendula officinalis L) – одно из самых популярных растений в народной и научной медицине. Препараты на основе экстрактов из цветов данного растения обладают широким спектром биологической активности, включая: противовоспалительное, спазмолитическое, желчегонное, противомикробное, успокаивающее, противоотечное, гипосенсибилизирующее, антимитотическое, противовирусное, ранозаживляющее действие. [1-3]
Лечебные свойства календулы обусловлены, в том числе, высоким содержанием флавоноидов, которые относятся к одному из наиболее распространенных классов природных органических соединений. Помимо того, что они интересны с точки зрения химико-фармацевтических свойств, флавоноиды являются основными компонентами окрашенных растительных экстрактов, использующихся для колорирования текстильных материалов, что делает их интересным объектом для изучения не только фармакологами, но и химиками, занимающимися поиском экологически безопасных красителей для текстильной промышленности.
Вышесказанное обуславливает необходимость изучения качественного и количественного состава флавоноидов календулы лекарственной с целью их дальнейшего практического использования.
Из анализа литературных данных известно, что состав флавоноидов Календулы лекарственной весьма разнообразен, однако основными соединениями, входящими в состав экстрактов являются изокверцитин (1) и нарцисин (2) [4-7]
1 2
Целью настоящей работы являлась разработка и валидация методики количественной оценки содержания флавоноидов в сырье календулы лекарственной различных сортов.
Результаты и их обсуждение
Анализ электронных спектров поглощения (ЭСП) спиртовых экстрактов Календулы лекарственной (рис. 1) показал, что прямое количественное определение флавоноидов по данным ЭСП невозможно, так как положение максимумов их полос поглощения «маскируется» более интенсивными полосами поглощения других компонентов экстрактов. Поэтому было предложено спектрофотометрический метод, основанный на использовании реакции комплексообразования флавоноидов с AlCl3, в результате которой происходит батохромный сдвиг полосы поглощения флавоноидов с 330-350 до 390-410 нм [8-11]. Нами установлено, что при добавлении к спиртовому экстракту Календулы лекарственной спиртового раствора AlCl3 в ЭПС появляется максимум поглощения при 395 нм, который совпадает с максимумом поглощения спектра комплекса рутина с AlCl3 и это позволяет проводить анализ при данной длине волны. Поскольку реакция комплексообразования является селективной для флавоноидов, исключается влияние остальных компонентов экстрактов на процесс определения количественного состава флавоноидов.
Рис. 1. Электронные спектры поглощения (ЭСП)
1 – спектр поглощения спиртовых экстрактов Календулы лекарственной; 2 – спектр поглощения спиртовых экстрактов Календулы лекарственной после добавления 2% раствора AlCl3; 3 – Спектр поглощения раствора стандартного образца рутина; 4 – Спектр поглощения раствора стандартного образца рутина после добавления 2% раствора AlCl3;
На первом этапе работы с использованием вышеуказанного метода были проведены исследования по оптимизации условий экстракции флавоноидов из цветов Календулы лекарственной, результаты которых приведены в табл. 1 и 2.
Таб. 1. Результаты определения оптимальных условий реакции флавоноидов с хлоридом алюминия.
Условия реакции | Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин. % |
Соотношение 2% спиртовой раствор AlCl3 : экстракт, мл 0.5:1 1:1 1:1.5 1:2 1:2.5 | 3.14 3.68 3.67 3.66 3.67 |
Время реакции, мин 5 10 15 20 30 40 60 | 3.19 3.35 2.49 3.61 3.68 3.60 3.48 |
Табл. 2. Результаты определения влияния условий экстракции на выход флавоноидов из цветов Календулы лекарственной.
Условия реакции | Содержание суммы флавоноидов, % |
Размер частиц сырья, мм 5-7 1-2 | 2.75 3.68 |
Концентрация экстрагента (этанола), % 60 70 95 | 2.74 3.68 3.54 |
Соотношение количества сырья и экстрагента 1:10 1:20 1:40 1:50 | 2.14 2.24 3.68 3.15 |
Время экстракции, мин 40 60 80 120 | 2.78 3.26 3.68 3.77 |
На основе полученных результатов была предложена методика определения суммы флавоноидов с использованием в качестве стандартного образца рутина.
Экспериментальная часть
Экстракция.
Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 1-2 мм, около 1 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляют 40 мл 70% этанола, колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водной бане в течение 40 мин. Затем колбу охлаждают до комнатной температуры под струей холодной воды и фильтруют экстракт в мерную колбу вместимостью 100 мл. Экстракцию проводят повторно указанным выше способом. Экстракт фильтруют через тот же фильтр в ту же мерную колбу, фильтр промывают 70% этанолом и доводят объем раствора до метки этиловым спиртом (70%) (раствор А).
Определение суммы флавоноидов.
В мерную колбу на 50 мл помещают 2 мл раствора А, прибавляют 2 мл 2% раствора AlCl3 и 0.5 мл 30% раствора уксусной кислоты. Доводят объем колбы до метки 70% этанолом. Через 30 минут измеряют оптическую плотность исследуемого раствора и раствора стандартного образца рутина при длине волны 395 нм в кювете с толщиной 10 мм. В качестве раствора сравнения используют раствор из 2 мл исследуемого экстракта, который помещают в мерную колбу на 50 мл, прибавляют 0.5 мл 30% уксусной кислоты и доводят объем до метки 70% этанолом. Одновременно измеряют оптическую плотность раствора стандартного образца (РСО) при аналогичных условиях.
Для приготовления РСО точную навеску рутина помещают в колбу на 100 мл, растворяют в небольшом количестве раствори% этанол) при нагревании, охлаждают и доводят раствор до метки.
Содержание флавоноидов в цветах Календулы лекарственной определяют по формуле:
,
где Dx - оптическая плотность исследуемого раствора; D0 - оптическая плотность РСО рутина; mx- масса сырья (г); m0- масса рутина в РСО (г); W - потеря в массе при высушивании сырья (%)
Математическая обработка данных.
Квалификация методики (валидация) проводилась по таким параметрам как правильность, повторяемость, воспроизводимость и линейность. [12-13]
Правильность методики устанавливали путем измерения количественного содержания суммы флавоноидов в пересчете на рутин в растворах, полученных путем добавления определенного количества стандарта к исследуемому раствору. Критерием приемлемости является средний процент восстановления при использовании растворов заданных концентраций, скорректированный на 100%, и его средняя величина должна находиться в пределах 100±5 %. В разработанной методике процент восстановления находился в пределах от 97.09 до 103.40%, его средняя величина составила 100.17% (табл. 3).
Табл. 3. Результаты оценки правильности методики количественного определения флавоноидов в экстракте методом добавок.
Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин, мкг | Добавлено СО рутина, мкг | Расчетное содержание, мкг | Найденное содержание, мкг | Открываемость, % |
0.459 | 0.6586 1.317 3.293 | 1.118 1.776 3.752 | 1.134 1.098 1.121 1.837 1.779 1.805 3.643 3.794 3.685 | 101.4 98.2 100.3 103.4 100.2 101.6 97.09 101.1 98.2 |
Средний процент восстановления, % | 100.17 |
Критерием оценки повторяемости является коэффициент вариации, который не должен превышать 4%. Он составляет 2.08% (табл. 4), что свидетельствует о прецизионности методики в условиях измерения.
Табл. 4. Результаты проверки повторяемости методики определения суммы флавоноидов.
№ измерения | Результаты определения суммы флавоноидов искомой методикой |
1 2 3 4 5 6 | 3.65 3.68 3.62 3.51 3.68 3.53 |
Среднее значение | 3.61 |
Среднее квадратичное отклонение S | 0.0747 |
Коэффициент вариации, % | 2.08 |
Мерой линейности является коэффициент корреляции и если его величина близка к единице, то совокупность данных можно описать прямой линией. Величина коэффициента корреляции должна быть не ниже 0.98. Коэффициент корреляции составил 0.9903 (табл. 5, рис. 2)
Табл. 5 Результаты определения линейности методики
Объем аликвоты | Оптическая плотность раствора |
0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 | 0.302 0.458 0.723 1.001 1.165 |
Коэффициент корреляции | 0.9903 |
Рис. 2. Линейность методики
Таким образом предложенная нами методика является достаточно точной и имеет хорошую воспроизводимость при том, что для ее реализации не требуется сложных приборов и операций, а так же большого количества времени.
После отработки методики на сорте Календулы лекарственной «Кальта» (этот сорт был взят в качечтва стандарта), нами был изучен ряд других сортов этого растения и проведен сравнительный анализ содержания флавоноидов. Результаты исследований приведены в табл. 5
Табл. 5. Содержание флавоноидов в различных сортах календулы лекарственной.
Сорт Календулы лекарственной | Содержание флавоноидов, % |
«Кальта» (стандарт) | 3.68±0.57 |
«Солнышко» | 3.47±0.64 |
«Зеленое сердце» | 2.99±0.43 |
«Оранжевые лучи» | 3.70±0.35 |
Выводы
Как видно из таблицы 5, максимальным содержанием суммы флавоноидов характеризовался сорт Оранжевые лучи (3,70%), что не существенно превышало показатель стандарта (3,68%).
В результате проведённых исследований подобраны оптимальные условия экстракции флавоноидного комплекса из сырья календулы лекарственной и предложена методика извлечения суммы флавоноидов, характеризующаяся с одной стороны простотой, с другой высокой воспроизводимостью и точностью.
Проведена сравнительная оценка содержания суммы флавоноидов в четырёх сортах календулы лекарственной и показаны существенные различия, что следует учитывать при выборе сорта для выращивания.
Литература
, Костылев . Уфа, 2000. 102 с. Ладыгина, лекарственная // Фармация. 1992. Т.40. №4. С. 84–86. Куркин : Учебник для студентов фармацевтических вузов. Самара, 2004. 1180 с Государственная фармакопея СССР. 11-е издание. Вып. 1 и 2. М., 1991. Т. 2. Слуева, Е. К., , Деревщикова содержания суммы флавоноидов в настойке календулы // Фармация. 2003. Т. 51. №1. C. 13–15. , Тулаганов метода количественного анализа цветков календулы лекарственной // Химико-фармацевтический журнал. 2001. Т. 35. №10. С. 25–26 , Куркин растительного сырья. 2007. №1 с.65-68 , Точкова комплексообразования в анализе флавоноидов.// Фенольные соединения и их физиологические свойства. Алма-Ата, 1973. С. 168. енольные соединения растительного происхождения. М., 1977. , и др. Химический анализ лекарственных растений. М., 1983. С. 130. Mabry T. J., Markham K. R., Thomas M. B. The systematic identification of flavonoids. N. Y., 1970 ГОСТ Р ИСО 5725-3-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерения» часть 3 //Промежуточные показатели прецизионности стандартного методов измерения. – М.: Госстандарт, 28 с. Мешковский аналитических методов / Современные требования к организации и деятельности контрольноаналитических лабораторий отделов контроля качества фармацевтических предприятий: Сборник. М., 2002.С. 2630
