VII. ИССЛЕДОВАНИЕ НА ПРЕПАРАТ НО-ШПА.
А). К 10мл крови добавляли 10 мл ацетатного буфера 2М с рН=4,18 и 10мл хлороформа. Флакон закрывали пробкой, встряхивали 5 минут, смесь разливали по центрифужным пробиркам и центрифугировали 5 минут при 4000 об./мин. Органический слой отделяли и фильтровали через безводный сульфат натрия. Растворитель испаряли в токе воздуха. Сухой остаток перерастворяли в 1 мл хлороформа и исследовали методом ТСХ.
Б). Кислые извлечения из органов и крови исследовали на наличие препарата но-шпа. Кислые хлороформные извлечения нанесли на 2 хроматографические пластинки 9x12 см, покрытые слоем силикагеля L-5/40. В качестве метчика нанесли 1%-ный хлороформный раствор но-шпы.
Первую пластинку хроматографировали в системе этилацетат: этанол;25%-ный раствор аммиака (85:10:5). Вторую пластинку хроматографировали в системе хлороформ:ацетон (9:1). После пробега фронта растворителей до 10см, пластинки подсушили при комнатной температуре до удаления запаха растворителей. На хроматограммах визуально наблюдали пятна желтого цвета со следующими значениями Rf: - 0,91 на первой; -0,65 - на второй. При исследовании этих пятен в УФ-свете отмечалось свечение с такими же значениями КГ как у метчика.
1-ую пластину опрыскивали реактивом Драгендорфа по Мунье, а затем 20%-ным раствором серной кислоты. В исследуемой зоне наблюдали образование пятен коричневого шла с желтым ободком с теми же значениями Rf как у метчика но-шпы.
2-ую пластину обработали реактивом Марки, наблюдали пятна фиолетового цвета с такими же значениями Rf как у метчика но-шпы.
В) СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ.
Спектрофотометрическое исследование: По 20 мл кислого и щелочного извлечения из исследуемого объекта (желудка, печени, почки) помещали в фарфоровые чашки, испаряли при комнатной температуре, растворяли в 5 мл 0,1 Н раствора соляной кислоты в 2 приёма, настаивая каждый раз по 5 минут. Элюаты соединяли, доводили до 5 мл в калиброванных пробирках 0,1 Н раствором соляной кислоты и снимали спектр в области 215-400 нм в кварцевой кювете толщиной 10мм на спектрофотометре Shimadzu UV 1700. Раствор сравнения - 0,1 Н раствор соляной кислоты. Наблюдали максимум адсорбции в области 303 и 350 нм для кислых извлечений из желудка, печени и почки. Полученные спектры соответствуют УФ-спектрам поглощения препарата но-шпа. В тех же условиях снимали спектр стандартного раствора но-шпы (с=0,25мкг/мл). Наблюдали максимумы адсорбции при тех же длинах волн. Для щелочных извлечений спектры неинформативны.
Для кислых извлечений максимумы адсорбции в области 303 нм соответствуют значениям оптической плотности: для желудка - 1,25; для печени - 0,99; для почки - 1,1. По калибровочному графику построенному ранее нашли концентрацию но-шпы в исследуемых растворах. По формуле пересчитываем содержание но-шпы в 100 г объекта. (См. калибровочный график, спектр стандартного раствора и формулу пересчета в приложении). Для щелочных извлечений спектры неинформативны.
