Статья по материалам доклада на конференции «Современные проблемы химической технологии биологически активных веществ». РХТУ им. . 26.05.2016 г.
Публикация доступна для обсуждения в рамках функционирования постоянно
действующей интернет-конференции “Бутлеровские чтения”. http:///readings/
УДК 616.5-006.81-033.2:616-097.1. Поступила в редакцию 23 июня 2016 г.
Получение и обнаружение антител различных модификаций
© Агафонова*+ Александра Николаевна и
Российский химико-технологический университет имени .
Ул. Героев Панфиловцев, 20. г. Москва, 125480. Россия. E-mail: *****@***ru
_______________________________________________
*Ведущий направление; +Поддерживающий переписку
Ключевые слова: антитело, антиген, рекомбинантное антитело, моноклональное антитело, иммуноферментный анализ.
Аннотация
В данной статье рассмотрены различные способы получения и обнаружения антител в различных модификациях, которые используются в вакцинах для лечения наркотической зависимости. Проанализированы особенности представленных методов иммунохимического анализа. Расширить аннотацию конкретикой!!!
Введение
Наркотическая зависимость – всемирная проблема, которая выкашивает миллионы людей, и ее уровень постоянно растет. Исключением не стал и метамфетамин, за последние два десятилетия количество наркоманов, зависимых от употребления метамфетамина (МЕТ, МА), значительно выросло и продолжает расти [1, 2]. В связи с этим сейчас идут активные разработки различных методов лечения МА наркомании. Большинство из них так или иначе связаны с использованием сопряженных с наркотиками вакцин, которые стимулируют опре-деленное антитело блокировать наркотическую зависимость.
Основная идея создания антител для борьбы с наркотиками состоит в создании нового высокомолекулярного соединения, которое организм распознает как чужеродный антиген, который нуждается в иммунной реакции. Наркотическая зависимость сама по себе являются слишком мала, чтобы вызвать такие иммунные реакции от генерирующих антител В - и Т-белых кровяных клеток, поэтому их представление в иммунных методах должно быть изме-нено с помощью сопряженной вакцины. Сопряженная вакцина химически связывает наркотик с большим иммуногенным белком.
1. Получение антител различных модификаций
На данный момент имеются две основные модификации антител, которые создаются искусственно – рекомбинантные и моноклональные.
Рекомбинантные антитела – специфичные к антигенам биомолекулы, получаемые мето-дами генной инженерии. Мишенями являются токсины и опухолевые клетки.
Существует два совершенно различных подхода к получению рекомбинантных антител. Первый заключается в получении рекомбинантных аналогов антител или их фрагментов. Второй связан с созданием множества вариантов последовательностей рекомбинантных антител (биб-лиотек) с последующим отбором из них антител требуемой специфичности и аффинности, то есть созданием антител необходимой специфичности denovo [3].
1.1. Создание рекомбинантных аналогов антител
Метод получения рекомбинантных антител или их фрагментов, идентичных антителам, полученным стандартным гибридомным методом, включает в себя стадии:
- Выделение тотальной или матричной РНК из клеток гибридомы, секретирующей антитела. Проведение синтеза первичной цепи кДНК (обратная транскрипция). Амплификация кДНК тяжелых и легких цепей методом полимеразной цепной реакции. Получение молекулярно-генетических конструкций, содержащих полученные к ДНК. Проведение экспрессии (или коэкспрессии) в подходящей экспрессионной системе. Выделение и очистка экспрессируемого белка.
Данный метод позволяет получить как полноразмерные антитела, так и ихфрагменты, а также легкую и тяжелую цепи антител.
1.2. Создание рекомбинантных антител и их фрагментов denovo
Альтернативным подходом является in vitro метод получения рекомбинантных антител или их фрагментов с использованием отбора из библиотек их белковых фрагментов на основе способности связывать антиген [4]. Блок методов, которые используются для решения задачи такого типа, носит название дисплейных. Важным достоинством этогоблока методов является возможность работать одновременно с нуклеотидной и аминокислотной последовательностью каждого конкретного варианта антитела. Получение рекомбинантных фрагментов антител, с использованием такого подхода, состоит из следующих этапов:
- Создание библиотек рекомбинантных ДНК антител. Экспрессия и презентациябелковых фрагментов антител на поверхности клеток или фаговых частиц (в зависимости от выбора конкретного вида дисплейного метода). Отбор подходящих белковых фрагментов антител на основе их взаимодействия с антигеном.
Если необходимо получить полноразмерное антитело, специфичное к соответствую-щему антигену, то сначала получают фрагмент антитела, а затем на его основе реконструи-руют полную нуклеотидную и аминокислотную последовательность антитела [3].
Принцип дисплея заключается в использовании объединенных в одном молекулярном комплексе нуклеотидной последовательности целевого белка и продукта его экспрессии [3].
Существуют несколько видов дисплейного метода: клеточный дисплей, фаговый дисп-лей, рибосомный дисплей, мРНК дисплей.
Моноклональные антитела – антитела, вырабатываемые иммунными клетками, принад-лежащими к одному клеточному клону, то есть произошедшими из одной плазматической клетки-предшественницы.
В [5] описана принципиальная схема получения моноклональных антител:
Мышей интенсивно иммунизируют определенным антигеном – белком, бактериальными клетками или клетками животного происхождения. Когда в их крови появлялись антитела, у них брали селезенку, и из неё готовили взвесь клеток (с большим содержанием В-лимфо-цитов). Если к суспензии В-лимфоцитов добавить клетки плазмоцитомы и полиэтиленгли-коль, то после инкубации, требующейся для слияния клеток, в системе находились следую-щие клетки:
- гибриды АОК и АОК (В-лимфоцитов и В-лимфоцитов); гибриды АОК и плазмоцитомы, а также оставшиеся свободными – АОК и клетки плазмо-цитомы (не слившиеся).
Проблема заключалась в том, как отделить заданную гибридому от присутствующих в системе отдельных не слившихся клеток и от гибридов иной специфичности. Для достижения этой цели авторы разработали специальную схему, использующую отбор клеток в селектив-ной питательной среде, то есть в среде, с помощью которой можно выделять желаемый клон клеток.
Прежде всего был получен особый мутант мышиной плазмоцитомы, рост которого можно было контролировать составом питательной среды. Для получения мутанта использовали особенности синтеза нуклеиновых кислот (ДНК и РНК), имеющихся во всех клетках и необходимых для их существования. Известно, что имеются два пути синтеза предшествен-ников нуклеиновых кислот: основной и резервный. Основной – это путь новообразования нуклеотидов, звеньев, входящих в состав нуклеиновых кислот. Этот путь включает несколько этапов и блокируется противоопухолевым препаратом аминоптерином (А). Однако клетки не гибнут от этого препарата, поскольку обладают резервным путем – способностью синте-зировать нуклеотиды и нуклеиновые кислоты, реутилизируя продукты распада ранее синтези-рованных нуклеиновых кислот: гипоксантина (Г) и тимидина (Т). Добавление Г и Т в пита-тельную среду, содержащую А, снимает токсический эффект последнего [6] .
Следующий этап после получения гибрида – клонирование и отбор нужных клонов. Выжившие в ГАТ клетки рассевали в специальные пластиковые планшеты, содержащие обычно 96 лунок емкостью примерно по 0.2 см3. В каждую лунку помещали в среднем по 10 гиб-ридомных клеток, которые культивировали в присутствии “кормящих” клеток, не имеющих отношения к гибридомам, но способствующих их росту. После нескольких дней культиви-рования содержимое каждой лунки проверяли на присутствие антител нужной специфич-ности. Для этого использовали микрометоды выявления антител к соответствующему анти-гену. Клетки из лунок, содержащих нужные антитела, клонировали, то есть повторно расе-вали по таким же лункам, но из расчета 1 клетка на лунку, вновь культивировали и проверяли на присутствие нужных антител. Процедуру повторяли 1-2 раза.
Таким образом, отбирали клоны, продуцирующие антитела только одной нужной спе-цифичности, то есть моноклональные антитела. Полученные клоны можно заморозить при −70 °С и хранить до того, пока они не потребуются.
В силу ряда преимуществ, которыми обладают рекомбинантные антитела и их фраг-менты, область их потенциального применения значительно шире, чем у моноклональных антител, причем в первую очередь – из-за возможности их использования в качестве терапевтических агентов при лечении различных заболеваний.
2. Обнаружение антител различных модификаций
На практике применяются различные методы обнаружения антител. Самым удобным и распространенным считается иммуноферментный анализ.
Иммуноферментный анализ (сокращённо ИФА, англ. enzyme-linkedimmunosorbentassay, ELISA) – лабораторный иммунологический метод выявления антигенов и антител, основан-ный на определении комплекса «антиген-антитело» за счет введения в один из компонентов реакции ферментативной метки с последующей ее детекцией с помощью соответствующего субстрата, изменяющего свою окраску. Основой проведения любого варианта ИФА служит определение продуктов ферментативных реакций при исследовании тестируемых образцов в сравнении с негативными и позитивными контролями.
Для определения антигенов и антител применяются твердофазный (гетерогенный) вари-ант иммуноферментного анализа. Использование твердой фазы позволяет упростить процесс разделения компонентов реакции за счет иммобилизации одного из компонентов на твердой фазе и удаления субстанций, не участвующих в реакции [7].
На данный момент разработано три базовых варианта твердофазного иммунофермент-ного анализа:
«Сэндвич»-метод. Разработан для антигенов, на которых есть не менее двух неперек-рывающихся эпитопов. Против обоих эпитопов получают в качестве реагентов специфичные антитела. Антитела к одному из эпитопов сорбируют на твердой фазе. Испытуемую пробу добавляют к твердой фазе, инкубируют, отмывают. После отмывки вносят конъюгат антител ко второму эпитопу с ферментом. Ферментативная активность, остающаяся на твердой фазе, прямо пропорциональна содержанию антигена в пробе. Данный метод не требует препаратов очищенных антигенов, что выгодно отличает его от конкурентных и ингибиторных методик, поскольку чистые антигены всегда труднодоступны и дороги [8].
Непрямой ИФА. В данном методе антиген иммобилизован на твердую фазу. После блокировки, к антигену добавляют раствор специфических к нему антител. После инкубации, комплекс антиген-антитело отмывают от несвязавшихся антител и добавляют меченый анти-иммуноглобулин (анти-Ig), выступающий в роли детектора. Анти-Ig детекторы коммерчески доступны для конкретных классов и подклассов Ig, что делает этотформат анализаудобным для изотипирования антител. Кроме того, использование меченого анти-Ig усиливает сигнал по сравнению с прямым методом иммуноферментного анализа, тем самым увеличивая чувст-вительность анализа [9].
Прямой ИФА. На первом этапе растворенный в буфере анализируемый антиген вно-сится в пластиковую лунку (твердая фаза). Затем в течение определенного времени происхо-дит инкубация антигена в лунках. В процессе инкубации происходит иммобилизация анти-гена на твердую фазу. После инкубации проводят отмывку, чтобы удалить свободные моле-кулы антигена. Для процедуры отмывки используют нейтральный буферный раствор. После этого к иммобилизованному на пластиковой поверхности антигену добавляются антитела, конъюгированные с ферментом, которые специфичны данному антигену и напрямую связы-ваются с ним. После инкубации вновь проводят процедуру отмывки и вносят в лунки соот-ветствующий ферменту субстрат. Через определенное время после развития окраски фермен-тативную реакцию останавливают, добавляя ингибирующий реагент. Последним этапом яв-ляется количественное определение оптической плотности окрашенного раствора с помощью спектрофотометрического оборудования [10].
Выводы
????????
Литература
Xiaoyun Y. Shen, Therese A. Kosten, Angel Y. Lopez, Berma M. Kinsey, Thomas R. Kosten, and Frank M. Orson; «A vaccine against methamphetamine attenuates its behavioral effects in mice». Published in final edited form as: Drug Alcohol Depend. 2013. Vol.129. No.1-2. P.41-48. Amira Y. Moreno, Alexander V. Mayorov, and Kim D. Janda; «The Impact of Distinct Chemical Structures for the Development of a Methamphetamine Vaccine». Published in final edited form as: J Am Chem Soc. 2011. Vol.133. No.17. P.6587-6595. Альтшулер E. П., , Получение рекомбинантных антител и способы увеличения их аффинности. Успехи биологической химии. 2010. Т.50. С.203-258. L. G. Presta. J. Allergy Clin. Immunol. 2005. No.116. P.731-736. Моноклональные антитела. Использование в диагностике заболеваний и лечебные моноклональные антитела. Методические рекомендации для студентов лечебного, педиатрического, стоматологического и фармацевтического факультетов. ГБОУ ВПО Тверская ГМА Минздрава России, кафедра микробиологии и вирусологии. 2012. 22с. Моноклональные антитела. Соросовский образовательный журнал. 1998. №1. C.16-20. D5@http://www.ibmc.msk.ru/content/Education/w-o_pass/MMoB/8.pdf D5@ , , Иммунология: практикум, учебное пособие. М.: ГЭОТАР - Медиа. 2010. Метод иммуноферментного анализа. Министерство здравоохранения Российской Федерации. Государственный стандарт качества лекарственного средства. Общая фармакопейная статья. 11с. Основы метода иммуноферментного анализа. Учебное пособие для студентов лечебного факультета. ГОУ ВПО Московский Государственный Медико-Стоматологический Университет. 2010. 58с.In the English version of this article, the Reference Object Identifier – ROI: jbc-02/16-46-6-24
Preparation and detection of antibodies of various modifications
© Alexandra N. Agafonova,*+ and Yury A. Leykin
Department of Biotechnologies. Russian University of Chemical Technology Name after D. I. Mendeleev.
Heroev Panfilovcev St., 20. Moscow, 125480. Russia. E-mail: *****@***ru
___________________________________
*Supervising author; +Corresponding author
Keywords: antibody, antigen, recombinant antibody, a monoclonal antibody, an enzyme immunoassay.
Abstract
This article describes the various methods of making and detecting antibodies in various modifications, which are used in vaccines for the treatment of drug addiction. The features provided by immunochemical assays. Расширить аннотацию конкретикой!!!
