1*, 1, 2, 3, 1
Изучение полиморфизма гена DC-SIGN у больных, пораженных штаммами Mycobacterium tuberculosis различных генотипов в Иркутской области (Восточная Сибирь)
1ГУЗ Иркутский областной клинический консультативно-диагностический центр, 2 ГУЗ Иркутский областной противотуберкулезный диспансер, 3ГУЗ Иркутское областное патолого-анатомическое бюро, Иркутск. * e-mail для переписки: *****@***ru
Ключевые слова: MIRU-VNTR, DC-SIGN, семейства штаммов туберкулеза, гены устойчивости к туберкулезу.
По оценкам ВОЗ, приблизительно треть человеческой популяции инфицирована M. tuberculosis [8]. В 2000 г по всему миру зарегистрировано 8-9 миллионов новых случаев туберкулеза и около 3 миллионов летальных исходов от этого заболевания [7]. Безусловно, доминирующим генотипом является «пекинский» («Beijing»), во многом это семейство штаммов M. tuberculosis, ответственно за текущую пандемию туберкулеза [14]. Более того, считается, что для регионов с высоким распространение «пекинского» генотипа БЦЖ вакцинация может быть малоэффективна [4]. Иркутская область является одним из регионов России с высокой заболеваемостью туберкулезом, при этом количество штаммов «пекинского» генотипа, циркулирующих в области, близко к 50% [1, 2].
Первой линией обороны человеческого организма от патогенов являются механизмы неспецифического иммунитета, отвечающие за раннее распознавание и утилизацию микроорганизмов. В первую очередь к эффекторам этого звена иммунной системы относятся фагоциты - макрофаги и дендритные клетки. Фагоцитирующие клетки экспрессируют ряд клеточных рецепторов, известных как паттерн-распознающие (pattern recognition receptors) [17]. На одном из таких рецепторов – CD209 (ген DC-SIGN) в последнее время сосредоточено внимание многих исследователей в связи с его важной ролью при туберкулезе [20] и ряде других инфекций [17]. Эти результаты послужили стимулом для работ, посвященных изучению генетической вариабельности гена DC-SIGN и ее влиянию на чувствительность в инфекционным болезням [5, 17, 19]. Для жителей Южной Африки была обнаружена протективная роль от туберкулезной инфекции генотипов -871G и -336A, т. е. нуклеотидных замен в промоторной области гена DC-SIGN [5]. Кроме того, полиморфизм промоторной области DC-SIGN гена может ассоциироваться с вероятностью поражения человека возбудителями приобретенного иммунодефицита и болезни Денге [17]. Однако, исследование -336 A/G полиморфизма представителей европейской популяции (Испания) не выявило достоверных различий между когортой больных туберкулезом и здоровым контролем [11].
Задачей настоящего исследования явилось исследование полиморфизма промотора DC-SIGN гена в позициях -336 и -871 в группе больных легочным туберкулезом по сравнению с группой здоровых, проживающих в Иркутской области, с учетом данных о генотипах туберкулезных штаммов.
Материалы и методы
Сбор биологических образцов. Использовано 2 выборки, составленных из жителей Иркутской области преимущественно славянской национальности. Первая выборка – клинические образцы (кровь или щечный соскоб), полученные от 134 больных легочным туберкулезом, проходивших лечение в 2004-2006 гг в областном противотуберкулезном диспансере, расположенном в г. Иркутске, для 90 пациентов данной выборки были исследованы штаммы M. tuberculosis на полиморфизм MIRU-VNTR повторов [15]. Вторая выборка – образцы полученные от здоровых индивидуумов в количестве 112 человек (кровь, щечный или урогенитальный соскоб), от пациентов, проходивших плановый медицинский осмотр или исследование на инфекции, передающиеся половым путем, в Иркутский диагностическом центре (ДЦ). В качестве критерия отбора контрольной группы использовались следующие параметры: отсутствие в анамнезе туберкулеза, сахарного диабета и других гормональных нарушений. Информация о пациентах и клинических образцах получена с помощью информационных систем МИС и ЛИС ДЦ (http://www. dc. baikal. ru/company/teh/mis/).
ДНК от больных туберкулезом и здоровых индивидуумов выделялась из урогенитальных или щечных соскобов и концентрата полиморфноядерных лейкоцитов (ПЯЛ) крови набором «ДНК-сорб» производства ЦНИИ Эпидемиологии по протоколу производителя. Концентрат ПЯЛ получали следующим образом, в полипропиленовом виале объемом 1,7 мл смешивали в равных объемах – по 700 мкл 3% раствора желатина для инъекций и цельной крови, стабилизированной ЭДТА (из вакуэт). Пробирки оставляли в вертикальном положении при комнатной температуре до появления 30-50% гематокрита. Супернатант, содержащий ПЯЛ, отбирали в новый виал, клетки осаждали центрифугированием, осадок использовали для выделения ДНК или хранили при -70о С.
Полиморфизм промотора гена DC-SIGN в позициях -336 A/G и -871 A/G [5] (номера SNP в NCBI: rs4804803 и rs735239, соответственно) определяли ПЦР в реальном времени с использованием “шпилечных” праймеров [12] собственного дизайна на амплификаторе iQ-Cycler (БиоРад, США) в 20 мкл реакционой смеси следующего состава: 1х ПЦР буфер (Интерлабсервис); 3 мМ MgSO4 (Интерлабсервис); смеси олигонуклеотидов (Синтол) в эквимолярных концентрациях (см таблицу 1), состоящей из общего и одного из дискриминирующих праймеров; флуоресцентного красителя SybrGreen II (Sigma, S-9305) в конечном разведении 1/10000; 4NTP (Интерлабсервис) в конечной концентрации 200 мкМ каждого нуклеотида; модифицированной TaqF полимеразу (Интерлабсервис) по 1 ед на реакцию и ДНК образца в концентрации около 50 нг на реакцию. ПЦР инициировалась 15-ти минутным прогревом реакционной смеси при 95о С (для активации TaqF полимеразы) с последующей амплификацией в течение 45 циклов, состоящей из этапов: плавление при 95о – 30 сек.; отжига при 67о и 56о (для -336 и -871 локусов, соответственно) – 30 сек. ; элонгации при 72о – 20 сек. В конце реакции анализировались кривые плавления ПЦР-продуктов для исключения неспецифических реакций.
Таблица 1
Частоты генотипов и соответствие наблюдаемых частот ожидаемому равновесию по Харди-Вейнбергу определяли с помощью программы Arlequin 3.0 [9] (http://cmpg. unibe. ch/software/arlequin3). Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета программ Statistica 6.0. Поло-возрастные различия между группами сравнивали с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни. Сравнение частот аллелей и генотипов между различными группами проводили с использованием критерия Ч2 . Отношение шансов (OR) обнаружения того или иного генотипа и их комбинаций в исследуемых группах вычисляли по стандартной формуле:
, где A и C – количество исследуемых генотипов в группе, B и D – общее количество генотипов в группе. Доверительный интервал (CI) для OR определяли по формулам L=ln(OR)-txm; U=ln(OR)+txm, где ln(OR) – натуральный логарифм для величины OR, L – нижняя граница CI для ln(OR), U – верхняя граница CI для ln(OR), t – значение t-критерия, m – стандартная ошибка для ln(OR) [3].
Сбор клинических изолятов M tuberculosis. Штаммы из бактериологической лаборатории Иркутского областного противотуберкулезного диспансера (ОПТД) собирали бактериологической петлей со среды Левенштейн-Йенсена в полипропиленовые виалы. Выделение ДНК микобактерий и MIRU-VNTR типирование проводили, как описано ранее [1]. Принадлежность исследованных MIRU-VNTR паттернов к известным семействам туберкулезных штаммов определяли по алгоритму предложенному S. Ferdinand с соавт. [10]. Группу штаммов, обозначенную в данной работе как «Ural» определяли в соответствии с критериями, описанными в работе Kovalev S. Y. с соавт. [13], и в наших собственных исследованиях (описана как Haarlem 4) [2]
Построение Минимального Связующего Древа - MST (Minimum Spanning Tree) между MIRU-VNTR генотипами проводили с помощью программы Network (http://www. ) [18].
Результаты и обсуждение
Средний возраст группы здоровых составил 41,94±9,21 года, а для группы больных туберкулезом 42,29±12,11 лет, в соответствии с критерием Манна-Уитни между группами больных туберкулезом и здоровых индивидуумов не наблюдалось значимых различий по возрасту и полу. Гетерозиготность по локусу -336 A/G в обеих выборках соответствовала ожидаемой при равновесии Харди-Вейнберга. В отличие от этого, по локусу -871 A/G как в выборке здоровых, так и в выборке больных туберкулезом, гетерозиготность была значимо выше ожидаемой (с= 0,002 и 0,000, соответственно).
В табл. 2 и 3 приведены абсолютные и относительные значения (частоты) генотипов и аллелей гена DC-SIGN в позициях промотора -336 и -871. Проводилось сравнение следующих групп: 134 больных легочным туберкулезом и 112 здоровых индивидуумов. Среди больных легочным туберкулезом 44 - были поражены «пекинским» генотипом («Beijing»), а 46 – другими генотипами («non-Beijing») (см. рисунок). При сравнении когорты больных туберкулезом с группой сравнения (здоровые) ни в позиции -336, ни в позиции -871 не наблюдалось выраженных различий (табл. 2 и 3). При этом, если -336A/G полиморфизм исследованной славянской популяции (когорта «здоровые») незначительно отличается от мультинациональной группы (европейцы + азиаты), исследованной Barreiro, L. B с соавт. [5], то -871 A/G полиморфизм контрольной группы весьма разительно отличается от вышеуказанной мультинациональной группы (данные не приводятся). Не исключено, что одной из причин такого рода различий является отсутствие функциональной роли нуклеотидной замены в -871 положении промотора в отличие от замены в -336 [19]. Другими словами, предварительное рассмотрение полученных результатов могло бы привести к выводам, аналогичным выводам Gomez L. M с соавт. [11], об отсутствии достоверных различий в полиморфизме изучаемых однонуклеотидных замен (SNP) у больных туберкулезом и здорового контроля. Однако, поскольку для 90 туберкулезных больных ранее были получены данные о принадлежности штаммов возбудителя туберкулеза к тому или иному генетическому семейству, было исследовано распределение генотипов пациентов по DC-SIGN в зависимости от того, к какому генотипу принадлежит штамм M. tuberculosis, выделенный от того же пациента (см. рис. и табл. 4).
Таблица 2
Таблица 3
Было обнаружено, что распределение пар пациент-штамм (табл. 4) в зависимости от принадлежности штамма к тому или иному семейству позволяет выявить, по крайней мере, две группы туберкулезных пациентов, различающихся по полиморфизму промотора в -336 позиции. Было выявлено, что у больных, пораженных «пекинским» («Beijing») генотипом, значительно реже встречается аллель -336G, чем у больных, пораженных другими генотипами (табл. 2, 4, 5). В противоположность этому, полиморфизм промотора в позиции -871 при аналогичном сравнении не выявляет существенных отличий (табл. 3).
Таблица 4
В табл. 5 приводятся статистические показатели, подтверждающие вышесделанные предположения. Если сравнение общей группы больных туберкулезом с контрольной группой не выявляет сколько бы значимых различий, то при аналогичном исследовании группы больных, пораженных «пекинским» генотипом («Beijing»), по сравнению с группой больных, инфицированных всеми остальными генотипами («non-Beijing»), наблюдаются достоверные различия, в соответствии с критерием «хи-квадрат» (Ч2) [3]. Так же в табл. 5 приводятся значения по критерию «отношение шансов» (OR) обнаружения того или иного генотипа в исследуемых выборках. Несмотря на значение OR > 1, результаты сравнения групп «Beijing» и «non-Beijing» не могут быть признаны достоверными при 95% доверительном интервале (CI) [3].
Таблица 5
Рисунок
Поскольку распределение генотипов штаммов M. tuberculosis по семействам в соответствии с алгоритмом S. Ferdinand с соавт. [10] является для метода MIRU-VNTR в известной мере косвенным и опирается в первую очередь на данные сполиготипирования, то для уточнения анализа была предпринята попытка выявить наиболее близкородственные генотипы для «пекинского» семейства туберкулезных штаммов методом Минимального Связующего Древа - MST между MIRU-VNTR генотипами, являющегося в данном случае более информативным, чем другие методы моделирования эволюционных событий [2, 18]. На рисунке овалом выделена группа генетически наиболее близкая к «пекинским» генотипам (обозначена как «Beijing-like»). Помимо собственно «пекинского» генотипа, в группу включены узлы, отстоящие от узлов «пекинского» генотипа не более чем на два мутационных события. Паттерны № 1 и 8 (см. табл. 4, на рисунке – круги, разделенные на сегменты), входящие в Beijing-like группу, являются наиболее распространенными не только в Иркутской области, но и в целом по России [2, 16] У больных, пораженных штаммами из «Beijing-like» группы, -336G генотип встречается более чем в 2 раза реже, чем во всех остальных группах (частоты 0.09 и 0.24, соответственно, табл. 5). При этом известно, что -336A/G полиморфизм приходится на сайт связывания регулятора транскрипции Sp1 и вероятно несет функциональную нагрузку. В экспериментах in vitro вариант промотора -336G более активно связывается с Sp1 регулятором транскрипции, в результате чего экспрессия гена DC-SIGN значимо снижалась. [19]. Другими словами, при кажущейся генетической близости штаммов возбудителя туберкулеза [6], «пекинский» генотип и близкородственные ему штаммы вероятно значительно отличаются от других семейств при взаимодействии с иммунной системой людей. В пользу последнего утверждения свидетельствуют и факты о большей вирулентности «пекинского» семейства за счет более интенсивной продукции фенол-гликолипидов, ускользания штаммов данного семейства от иммунного ответа за счет активации гуморального иммунного ответа и ряд других фактов [14]. Полученные результаты позволяют предполагать, что для «пекинского» и близкородственных ему генотипов туберкулезных штаммов интенсивность экспрессии CD209 рецептора на поверхности дендритных клеток не имеет такого большого значения, как для большинства других семейств туберкулезных штаммов, а протективность -336A генотипа для европеоидов зависит от генетических особенностей возбудителя. Безусловно, поскольку данное предположение базируется на косвенных данных о полиморфизме функционально значимого SNP -336A/G в гене DC-SIGN, полученные результаты требуют дальнейших исследований.
Проведенное исследование позволяет сделать следующие выводы:
- Исследование популяционного полиморфизма по -336 и -871 позициям промотора гена DC-SIGN (рецептор фагоцитирующих клеток CD209) не выявляет достоверных различий между выборкой больных туберкулезом и здоровым контролем среди жителей Иркутской области славянской национальности. Частота встречаемости –336A и –336G генотипов промотора гена DC-SIGN не отличается значительно от аналогичных данных, показанных для европейской и азиатской популяций [5]. Частота встречаемости –871A и –871G генотипов промотора гена DC-SIGN существенно отличается от известных, по литературным данным, частот в европейской и азиатских популяциях [5], однако, в исследованных группах больных туберкулезом и здорового контроля наблюдается достоверное увеличение гетерозиготности, поэтому полученные результаты не могут считаться достоверными. В отличии от -871 позиции, сравнение полиморфизма гена человека DC-SIGN по -336 позиции промотора, в зависимости от генетической принадлежности M. tuberculosis к известным семействам туберкулезных штаммов, выявило статистически значимое уменьшение генотипа -336G среди пациентов, пораженных «пекинским» генотипом и генетически родственными ему штаммами. Полученные результаты подтверждают данные о функциональной роли нуклеотидных замен в -336 позиции промотора гена DC-SIGN и позволяют предполагать, что уровень экспрессии CD209 рецептора для туберкулезных штаммов «пекинского» генотипа и близкородственных ему штаммов не играет значительной роли для развития заболевания, в отличие от других семейств туберкулезных штаммов. При изучении полиморфизма человеческой популяции по кандидатным генам чувствительности к туберкулезной инфекции следует учитывать распространенность в популяции штаммов «пекинского» семейства, поскольку, по всей вероятности, направление давления естественного отбора на заинтересованные гены человека могло меняться в зависимости от распространенности в популяции пандемических штаммов семейства «Beijing».
Таблица 1
Структура и концентрация олигонуклеотидов для определения полиморфизм промотора гена DC-SIGN в позициях -336 (A/G) и -871 (A/G)
Название | Структура | Конечная концентрация в ПЦР мкМ |
336R общ. | 5’-GGATGGTCTGGGGTTGACAG-3’ | 0,3 / 0,5 |
336T дискр. | 5’- AGGCAGGTACTGGGGGTGCTACCTGCCT-3 | 0,3 |
336C дискр. | 5’- GGGCAGGTACTGGGGGTGCTACCTGCCC-3’ | 0,5 |
871R общ. | 5’-GTCTCCTTCAAAGGTTAGTT-3’ | 0,3 / 0,5 |
871G дискр. | 5’- CGTTATTAAAAGTACTAGTACATTTAATAACG-3’ | 0,3 |
871A дискр. | 5’- TGTTATTAAAAGTACTAGTACATTTAATAACA-3’ | 0,5 |
Таблица 2
-336 A/G полиморфизм промотора гена DC-SIGN
Группа | аллель | Генотип | |||
A | G | AA | AG | GG | |
здоровые | 185/224 (0.83) | 39/224 (0.17) | 74/112 (0.66) | 37/112 (0.33) | 1/112 (0.01) |
Больные туберкулезом | 236/268 (0.84) | 44/268 (0.16) | 94/134 (0.70) | 36/134 (0.27) | 4/134 (0.03) |
Больные туберкулезом носители «пекинского» генотипа | 79/88 (0.90) | 9/88 (0.10) | 35/44 (0.80) | 9/44 (0.20) | - |
Больные туберкулезом носители «не-пекинских» генотипов | 72/92 (0.78) | 20/92 (0.22) | 27/46 (0.59) | 18/46 (0.39) | 1/46 (0.02) |
Таблица 3
-871 A/G полиморфизм промотора гена DC-SIGN
Группа | аллель | Генотип | |||
A | G | AA | AG | GG | |
здоровые | 135/224 (0.60) | 89/224 (0.40) | 41/112 (0.37) | 53/112 (0.47) | 18/112 (0.16) |
Больные туберкулезом | 160/268 (0.60) | 108/268 (0.40) | 54/134 (0.40) | 52/134 (0.39) | 28/134 (0.21) |
Больные туберкулезом носители «пекинского» генотипао | 56/88 (0.64) | 32/88 (0.36) | 20/44 (0.46) | 16/44 (0.36) | 8/44 (0.18) |
Больные туберкулезом носители «не-пекинских» генотипово | 57/92 (0.62) | 35/92 (0.38) | 20/46 (0.43) | 17/46 (0.37) | 9/46 (0.20) |
Таблица 4
-336 A/G полиморфизм ДНК от 90 пациентов и MIRU-VNTR генотипы штаммов M. tuberculosis, выделенных от этих же больных.
№ паттерна | MIRU-VNTR генотип штаммов M. tuberculosis | Семейство* M. tuberculosis | Кол-во штаммов MIRU-VNTR генотипа | -336 A/G полиморфизм ДНК пациента |
1 | 223325153533 | B | 26 | AG-6, AA-20 |
2 | 223325153523 | B | 1 | AA |
3 | 223325153534 | B | 1 | AA |
4 | 223325173523 | B | 1 | AA |
5 | 223325143533 | B | 1 | AA |
6 | 223325153633 | B | 1 | AA |
7 | 223325173532 | B | 1 | AA |
8 | 223325173533 | B | 12 | AG-3, AA-9 |
9 | 225325153323 | H | 2 | AG-1, AA-1 |
10 | 225325152333 | H | 1 | AA |
11 | 225315153323 | H | 1 | AA |
12 | 222325153323 | X | 1 | AG |
13 | 124325133225 | LAM | 1 | AA |
14 | 124326153227 | LAM | 1 | AA |
15 | 124325143225 | LAM | 1 | AA |
16 | 124326153222 | LAM | 1 | AG |
17 | 124326153224 | LAM | 1 | AG |
18 | 124326133224 | LAM | 1 | AG |
19 | 223215143321 | LAM | 1 | AG |
20 | 223126143323 | LAM | 1 | AG |
21 | 125326153227 | LAM | 1 | GG |
22 | 222325143533 | T | 1 | AA |
23 | 222325163533 | T | 1 | AA |
24 | 223325153532 | T | 1 | AA |
25 | 123315153224 | T | 1 | AA |
26 | 223125153322 | T | 1 | AA |
27 | 223325153433 | T | 1 | AA |
28 | 223325153522 | T | 1 | AA |
29 | 123326153224 | T | 1 | AA |
30 | 123325153224 | T | 2 | AG-1, AA-1 |
31 | 223125153422 | T | 1 | AA |
32 | 223325153223 | T | 1 | AG |
33 | 323125153324 | T | 1 | AG |
34 | 233125153224 | T | 1 | AG |
35 | 2110225113322 | Ural | 3 | AG-1, AA-2 |
36 | 229225113322 | Ural | 1 | AA |
37 | 229225113422 | Ural | 1 | AA |
38 | 2210225113222 | Ural | 1 | AA |
39 | 227225113322 | Ural | 1 | AG |
40 | 227227113323 | Ural | 1 | AG |
41 | 229225113223 | Ural | 1 | AG |
42 | 227225113222 | Ural | 1 | AG |
43 | 225325153324 | X | 1 | AA |
44 | 124326143224 | X | 1 | AA |
45 | 222125153322 | N | 1 | AA |
46 | 125326153228 | N | 1 | AA |
47 | 213125144325 | N | 1 | AA |
48 | 225326153223 | N | 1 | AA |
49 | 222225143324 | N | 1 | AG |
50 | 225225133423 | N | 1 | AG |
* - B – «Beijing» пекинский генотип, H – генотип «Haarlem», T – генотип «Т», U - генотип «Ural», LAM – латино-американско-средиземноморский генотип, X – генотип «X», N – генотип не определен
Таблица 5
-336 A/G полиморфизм у здоровых, больных туберкулезом и пациентов с известным генотипом штаммов M. tuberculosis
Гено-, Аллело-тип\группа | Здоровые. | туберкулез | Ч2; с | OR (CI 95%) |
AA | 74/112 (0.66) | 94/134 (0.70) | 0.47, 0.50 | 0.9 (0.6-1.4) |
AG | 37/112 (0.33) | 36/134 (0.27) | 1.11, 0.29 | 1.2 (0.7-2.1) |
GG | 1/112 (0.01) | 4/134 (0.03) | 1.34, 0.25 | 0.3 (0.0-2.7) |
A | 185/224 (0.83) | 224/268 (0.84) | 0.09, 0.77 | 1.0 (0.8-1.3) |
G | 39/224 (0.17) | 44/268 (0.16) | 0.09, 0.77 | 1.1 (0.7-1.7) |
Гено-, Аллело-тип\группа | Больные «Beijing» генотипом | Больные «non-Beijing» генотипами | Ч2; с | OR (CI 95%) |
AA | 35/44 (0.80) | 27/46 (0.59) | 4.56, 0.03 | 1.4 (0.7-2.6) |
AG | 9/44 (0.20) | 18/46 (0.39) | 3.74, 0.05 | 1.9 (0.8-4.7) |
GG | - | 1/46 (0.02) | - | - |
A | 79/88 (0.90) | 72/92(0.78) | 4.41, 0.04 | 1.1 (0.7-1.8) |
G | 9/88 (0.10) | 20/92 (0.22) | 4.41, 0.04 | 2.1 (0.9-4.9) |
Гено-, Аллело-тип\группа | Больные пораженные штаммами «Beijing-like» группы (рисунок) | Больные пораженные штаммами не вошедшими в группу «Beijing-like» (рисунок) | Ч2; с | OR (CI 95%) |
AA | 40/49 (0.82) | 22/41 (0.54) | 8.15, 0.004 | 1.5 (0.8-3.0) |
AG | 9/49 (0.18) | 18/41 (0.44) | 6.93, 0,009 | 2.4 (1.0-5.9) |
GG | - | 1/41 (0.02) | - | - |
A | 89/98 (0.91) | 62/82 (0.76) | 7,64, 0.006 | 1.2 (0.8-1.9)- |
G | 9/98 (0.09) | 20/82 (0.24) | 7,64, 0.006 | 2.7 (1.1-6.1) |
Подпись к рисунку. Приведено Минимальное Связующее Древо (Minimum Spanning Tree – MST), объединяющее 50 MIRU-VNTR паттернов от 90 штаммов M. tuberculosis. Узлы обозначены численно-буквенной абревиатурой, где число соответствует номеру MIRU-VNTR паттерна согласно табл. 4., буквы после числа обозначают принадлежность к одному из генотипов туберкулезных штаммов, B – «Beijing» пекинский генотип, H – генотип «Haarlem», T – генотип «Т», U - генотип «Ural», L – латино-американско-средиземноморский генотип «LAM», X – генотип «X», N – генотип не определен. Двух-буквенное обозначение в названии узла после пробела (AA, AG или GG) обозначает генотип по -336 локусу гена DC-SIGN пациента. В узлах, содержащих более одного штамма (на рисунке обозначены как круги разделенные на сегменты) вместо буквенного обозначения генотипа приведено числовое обозначение количества пациентов, от которых выделены штаммы данного генотипа. Полное соотношение генотипов пациентов по -336 локусу DC-SDIGN и генотипов туберкулезных штаммов по MIRU-VNTR повторам можно найти в табл. 4.
ЛИТЕРАТУРА
1. , , с соавт. MIRU-VNTR генотипирование штаммов Mycobacterium tuberculosis в Восточной Сибири: семейство Beijing против Kilimanjaro.” // Молекуляр. генет. микробиол. вирусол. - 2004. - № 4. - С.33-38
2. , , Zozio . с соавт. Молекулярное типирования штаммов микобактерий туберкулеза в Иркутской области (Восточная Сибирь) в 2000-2005 г. // Молекулярная медицина. - 2007. - № 2 в печати.
3. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ Statistica. - М. МедиаСфера., - 2003.- C. 312.
4. Abebe F., Bjune G. The emergence of Beijing family genotypes of Mycobacterium tuberculosis and low-level protection by bacille Calmette–Guйrin (BCG) vaccines: is there a link? // Clinical and Experimental Immunology. – 2006. – Vol. 145. – P.389–397.
5. Barreiro, L. B., Neyrolles O., Babb C. L. et al Promoter variation in the DC-SIGN - encoding gene CD209 is associated with tuberculosis. // PLoS Med. – 2006. - Vol. 3. – N.2. e20. – P.1-6.
6. Brosch R., Gordon S. V., Marmiesse M. et al. A new evolutionary scenario for the Mycobacterium tuberculosis complex // PNAS. - 2002. - Vol.99(6). - P.3684-3689.
7. Corbett, E. L., Watt C. J., Walker N., et al.. The growing burden of tuberculosis: global trends and interactions with the HIV epidemic. // Arch. Intern. Med. - 2003.- Vol.163. – P.1009–1021.
8. Dye C., Scheele S., Dolin P. et al. Consensus statement: global burden of tuberculosis : estimated incidence, prevalence, and mortality by country. // JAMA. -1999.- Vol.282. - P.677-686
9. Excoffier L., Laval G., Schneider S. Arlequin ver. 3.0 An integrated software package for population genetics data analysis. // Evolutionary Bioinformatics Online. - 2005. - Vol. 1. - P. 47-50.
10. Ferdinand S, Valetudie G, Sola C, Rastogi N. Data mining of Mycobacterium tuberculosis complex genotyping results using mycobacterial interspersed repetitive units validates the clonal structure of spoligotyping-defined families. // Res Microbiol. - 2004 – Vol.155. – N.8. - P.647-654.
11. Gomez L. M., Anaya J. M., Sierra-Filardi E. Analysis of DC-SIGN (CD209) functional variants in patients with tuberculosis. // Hum Immunol. – 2006. – Vol.67. –N.10. – P.808-811.
12. Hazbon M. H., Alland D. Hairpin Primers for Simplified Single-Nucleotide Polymorphism Analysis of Mycobacterium tuberculosis and Other Organisms // J. Clin. Microbiol. – 2004. - Vol.42. - N.3. – P.1236–1242.
13. Kovalev S. Y., Kamaev E. Y., Kurepina N. E. et al. Genetic analysis of Mycobacterium tuberculosis strains isolated in Ural region, Russian Federation, by MIRU-VNTR genotyping. // Int. J. Tuberc. Lung. Dis. - Vol.9. N.7. - P.746-752.
14. Mathema B., Kurepina N. E., Bifani P. J., Kreiswirth B. N. Molecular Epidemiology of Tuberculosis: Current Insights // Clinical Microbiology Reviews. – 2006. – Vol.19. – N.4. - P. 658–685
15. Mazars E., Lesjean S., Banuls. A. L. et al High-resolution minisatellite-based typing as a portable approach to global analysis of Mycobacterium tuberculosis molecular epidemiology // PNAS. - 2001.- Vol.98. - N.4. - P.1901–1906.
16. Mokrousov I, Narvskaya O, Otten T et al Phylogenetic reconstruction within Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype in northwestern Russia. // Res Microbiol. - 2002 – Vol.153. – N.10. - P.629-637.
17. Neyrolles O., Gicquel B., Quintana-Murci L. Towards a crucial role for DC-SIGN in tuberculosis and beyond // TRENDS in Microbiology. - 2006. - Vol.14. - N.9. - P.383-387.
18. Posada D, Crandall KA. Intraspecific gene genealogies: trees grafting into networks. // Trends Ecol Evol. - 2001. - Vol.16. - N.1. - P.37-45.
19. Sakuntabhai A., Turbpaiboon C., Casademont I. et al., A variant in the CD209 promoter is associated with severity of dengue disease. // Nat. Genet. - 2005. - N.5. - P.507-513.
20. Tailleux L, Schwartz O, Herrmann J, Pivert E, Jackson M, et al. DC - SIGN is the major Mycobacterium tuberculosis receptor on human dendritic cells. // J. Exp. Med. – 2003. – Vol.197. P. 121–127.
1*, 1, 2, 3, 1
Изучение полиморфизма гена DC-SIGN у больных, пораженных штаммами Mycobacterium tuberculosis различных генотипов в Иркутской области (Восточная Сибирь).
1ГУЗ Иркутский областной клинический консультативно-диагностический центр, 2 ГУЗ Иркутский областной противотуберкулезный диспансер, 3ГУЗ Иркутское областное патолого-анатомическое бюро, Иркутск. * e-mail для переписки: *****@***ru
Ключевые слова: MIRU-VNTR, DC-SIGN, семейства штаммов туберкулеза, гены устойчивости к туберкулезу.
Исследован полиморфизм промотора гена DC-SIGN у европеоидов в позициях -336A/G и -871A/G у 134 больных легочным туберкулезом и 112 здоровых индивидуумов, проживающих на территории Восточной Сибири. Для 90 человек из когорты больных выделена и исследована ДНК M. tuberculosis методом MIRU-VNTR типирования по 12 локусам. Сравнение полиморфизма гена DC-SIGN между больными туберкулезом и здоровым контролем не выявило достоверных различий по локусам -336A/G и -871A/G. Анализ MIRU-VNTR паттернов выявил 50 уникальных профилей, среди которых обнаружены генотипы семейств Beijing, T, LAM, Haarlem, Ural (Haarlem 4) и X. Среди 90 MIRU-VNTR генотипов 42 профиля принадлежали семейству Beijing, кроме того, методом Minimum Spanning Tree выявлен ряд Beijing-like штаммов. Проведено сравнение генотипов людей, пораженных Beijing и Beijing-like штаммами против генотипов пациентов, пораженных остальными семействами штаммов (non-Beijing). Выявлено достоверное снижение частоты встречаемости генотипа -336G среди людей, пораженных Beijing штаммами, по сравнению с non-Beijing, частоты 0.09 и 0.24, соответственно (X2=7,64, с=0,006; OR=2,7, CI95% (1.1-6.1)).
1*Ogarkov O. B., 1Medvedeva T. V., 2Nekipelov O. M., 3Antipina S. L., 1Menshikov M. L.
Investigation of polymorphism of DC-SIGN gene at patients affected with strains Mycobacterium tuberculosis various genotypes in Irkutsk region (Eastern Siberia)
1Irkutsk Regiona Diagnostic Center, 2 Irkutsk Regional Anti-tuberculosis Hospital, 3Irkutsk Regional Morbid Anatomy Bureau, Irkutsk, Russia,. * corresponded author: *****@***ru
Keywords: MIRU-VNTR, DC-SIGN, families of tuberculosis strains, genes of resistance to tuberculosis.
Polymorphism of the promoter of DC-SIGN gene at Caucasians in positions -336A/G and -871A/G at 134 patients with pulmonary tuberculosis and 112 healthy individuals living on territory of Eastern Siberia is investigated. For 90 persons from a cohort of patients DNA of M. tuberculosis is isolated and investigated by the method MIRU-VNTR typing by 12 parison of polymorphism of gene DC-SIGN among patients with tuberculosis and the healthy control has not display significant distinctions in loci -336A/G and -871A/G. Analysis MIRU-VNTR patterns has revealed 50 unique profiles. It was found families; Beijing, T, LAM, Haarlem, Ural (Haarlem 4) and X. Among 90 MIRU-VNTR genotypes 42 structures were belonged to Beijing and additional by the method of Minimum Spanning Tree revealed a number of Beijing-like of strains. It was examined genotypes of people affected by Beijing and Beijing-like strains versus genotypes of patients affected with other families (non-Beijing). It was is revealed significant decrease of frequency of -336G genotype of DC_SIGN gene among people affected by Beijing in comparison with non-Beijing strains, frequencies 0.09 and 0.24, accordingly (X2=7,64, с =0,006; OR=2,7, CI95 % (1.1-6.1)).
Контактная информация:
, к. б.н., зав. лабораторией молекулярной биологии Иркутского Диагностического Центра, , Иркутск, 664047, , e-mail: *****@***ru
