Оригинальная статья | DOI: 10.5582/ddt.2011.v5.4.190 |
Гиалуроновая кислота в сочетании с хондроитином сульфатом и гиалуроновая кислота в отдельности замедляют перерождение синовиальной оболочки и хряща (в опытах на кроликах) при остеоартрите.
Lei Chen1,2, Peixue Ling1,*, Yan Jin1, Tianmin Zhang3
1 Shandong Academy of Pharmaceutical Sciences, Ji′nan, Shandong, China;
2 Shandong Bausch & Lomb Freda Co., Ltd., Ji′nan, Shandong, China;
3 School of Pharmaceutical Sciences, Shandong University, Ji′nan, Shandong, China.
РЕЗЮМЕ: Данное исследование было проведено с целью сравнить хондропротекторный эффект инъекции хондроитина сульфата (ХС) в сочетании с гиалуроновой кислотой (ГК), (ХС-ГК) и инъекции ГК в экспериментальной модели остеоартрита.
После индукции остеоартрита 28 кроликов рандомизированно распределили в четыре группы лечения: контрольная группа, группа «ГК», группа «ХС» и группа «ХС-ГК». Через 7 дней после индукции остеоартрита кроликам в контрольной группе и группах «ГА», «ХС» и «ХС-ГК» инъекционно ввели в коленные суставы нормальный физиологический раствор, ГК, ХС или СХ-ГК соответственно. Всем кроликам инъекции производились один раз в неделю. Во всех группах лечение продолжалось в течение пяти недель подряд. После окончания лечения были проведены гистологическое и биохимическое исследования. На основании результатов гистологического исследования было установлено, что лечение с применением инъекций ХС-ГК оказывает хондропротекторное действие на ткани сустава, пораженные остеоартритом. Однако в группах «ГК» и «ХС-ГК» в результатах гистологического исследования значительных различий не наблюдалось (p > 0,05). Результаты биохимической оценки указывают на то, что уровни экспрессии ИЛ-1в, ФНО-б, TIMP-1 и NO в синовиальной жидкости всех животных, получивших лечение, отличались от таковых в контрольной группе (p < 0,05). Однако между показателями уровней экспрессии указанных биохимических молекул в трех группах лечения активными веществами значительных различий не наблюдалось (p > 0,05). Таким образом, было установлено, что в лечении остеоартрита инъекции ХС-ГК не обладают явным преимуществом перед инъекциями ГК.
Ключевые слова: Остеоартрит, гистологическая оценка, шкала Манкина, биохимическая оценка
*Адрес для направления корреспонденции:
Д-р Пейксу Лин, Шаньдунская фармацевтическая академия, Ксинлуо-Дацзиэ № 000, Цзинань 250101, Шаньдун, Китай.
Эл. почта: *****@***net
1. Вводная информация
Остеоартроз (в иностранной классификации остеоартирт) является одним из наиболее распространенных заболеваний среди людей среднего и пожилого возраста. В число основных признаков И СИМПТОМОВ остеоартрита входят медленно нарастающая суставная боль, скованность и гипертрофия суставов, которые сопровождаются ограничением суставной подвижности (1,2). Остеоартрит также называют остеоартрозом, дегенеративной артропатией, гипертрофическим артритом или старческим артритом (3). В клинической практике наиболее часто встречается остеоартроз коленного сустава. Этиология, патогенез и ход данного заболевания до сих пор точно не установлены (4). Результаты проведенных исследований указывают на то, что в патогенезе данного заболевания важную роль может играть воспаление синовиальной оболочки (5,6).
Хондроитина сульфат (ХС) – это полисахаридный комплекс класса гликозаминогликанов (ГАГ), состоящий из чередующихся последовательностей по-разному сульфатированных остатков D-глюкуроновой кислоты (ГлК) и D-N-ацетилгалактозамина (GalNAc), сшитых связями (1→3) (7). На основании научных доказательств и мета-анализа многочисленных клинических исследований в настоящее время Европейская лига по борьбе с ревматизмом (EULAR) рекомендует использовать ХС в странах Европы в качестве симптоматического медленно действующего лекарственного средства (SYSADOA) в лечении коленного сустава и остеоартрита суставов кистей рук (7-10). Кроме того, в ходе недавно проведенных клинических исследований были установлены их возможные структурно-модифицирующие эффекты (10,11). ХС предотвращает сужение суставной щели, а также уменьшает припухлость суставов и выпот в суставную полость. Описанные эффекты ХС обусловлены его противовоспалительным действием на хрящевые ткани и синовиальную оболочку (12).
Гиалуроновая кислота (ГК) – это гликозаминогликан, состоящий из D-глюкуроновой кислоты и D-N-ацетилглюкозамина и обладающий разносторонним биологическим действием. ГК с высокой молекулярной массой использовали в лечении остеоартроза у человека и животных. Было установлено, что внутрисуставные инъекции ГК в коленные суставы пациентов с остеоартрозом снижают интенсивность болевых симптомов и повышают подвижность суставов. Внутрисуставные инъекции ГК призваны восстановить утраченную вследствие воспаления вискоэластичность синовиальной жидкости и защитить хрящ от деградации (13,14).
Данное исследование было проведено с целью оценки влияния внутрисуставной инъекции ХС, ГК и их комбинации на остеоартроз, чтобы определить эффективность указанной комбинации в лечении остеоартроза. Также проводился мониторинг уровней таких биохимических молекул, как ИЛ-1в, ФНО-б, TIMP-1, iNOS и NO для оценки влияния комбинации ХС и ГК на воспалительный процесс.
2. Материалы и методы
2.1. Приготовление растворов для инъекций
ГК (для инъекций) с Mr 1,5 – 2,0 Ч 106 была получена из бактериального штамма Streptococcus zooepidemicus и поставлена компанией «Шаньдун Фреда Биофарм Ко., Лтд.» (Цзинань, Шаньдун, Китай). Очищенный ХС из свиных хрящей (Mw 35 – 50 кДа для инъекций) был закуплен в компании «ДонгЧенг Биокемикалз Ко., Лтд.» (Янтай, Шаньдун, Китай). Соотношение ХС-A к ХС-C составляло 5.6:1. Инъекционный раствор ХС и ГК (ХС-ГК инъекции) был приготовлен следующим образом: 2,0 г ХС растворили в 100 мл фосфатного буфера (pH 7,4); рН раствора скорректировали до 7,30 при помощи 0,05% раствора NaOH; поученный раствор нагревали при температуре 100 °C в течение 30 минут; после этого раствор остудили и профильтровали через мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм; затем к полученному раствору добавили 1,0 г гиалуроната натрия и полностью растворили гиалуронат натрия; полученный раствор дважды стерилизовали паром, каждый раз в течение 30 минут; шприцы заполнили инъекционным раствором ХС-ГК в асептических условиях, в каждом шприце содержалось по 3 мл раствора ХС-ГК.
Инъекционный раствор ХС (для инъекций) приготовили следующим образом: 2,0 г ХС растворили в 100 мл фосфатного буфера (pH 7,4); рН раствора скорректировали до 7,30 и нагревали при температуре 100 °C в течение 30 минут; после этого раствор остудили, профильтровали через мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм; затем раствор стерилизовали паром, каждый шприц содержалось по 3 мл раствора ХС. Также приготовили инъекционный раствор ГК. Вкратце, 1,0 г ГК смешали с 100 мл фосфатного буфера (pH 7,4) и полностью растворили вещество. После этого раствор стерилизовали и заполнили им шприцы в асептических условиях. В каждом шприце содержалось по 3 мл раствора ГК.
2.2. Индукция и лечение остеоартрита у кроликов (эксперимент на животных)
Папаин поставила фирма «Сигма-Алдрич» (Сент-Луис, Миссури, США). Взрослых новозеландских белых кроликов со сформировавшимся скелетом (с массой тела 2,5 – 3,0 кг) поставил Шаньдунский центр по оценке безопасности лекарственных средств (Цзинань, Шаньдун, Китай). Все кролики содержались в индивидуальных клетках. Остеоартроз индуцировали согласно методу, описанному в отчете (14): в оба колена каждого из кроликов под общей анестезией ввели по 0,3 мл стерильного раствора папаина (в 1 мл раствора содержалось 4,0 мг папаина и 50 мг гидрохлорида цистеина). После процедуры индукции остеоартрита 28 кроликов рандомизированно распределили в четыре группы лечения: контрольная группа, группа «ГК», группа «ХС» и группа ХС-ГК». Через 7 суток после индукции остеоартрита кроликам в контрольной группе (n = 7) в коленные суставы инъекционно ввели по 0,3 мл нормального физиологического раствора. Кроликам в группе «ГК» (n = 7), «ХС» (n = 7) и «ХС-ГК» (n = 7) в коленные суставы инъекционно ввели ГК, ХС и ХС+ГК соответственно. Всем кроликам инъекции производили один раз в неделю.
2.3. Гистологическая оценка
Через 7 дней после введения последней дозы животных умертвили и собрали суставные хрящи и синовиальные оболочки. Также собрали синовиальную жидкость. После проведения рутинных гистологических процедур, включая фиксацию образцов в 10% растворе формальдегида, образцы декальцифицировали в 10% растворе азотной кислоты. Образцы окрасили стандартным гематоксилин-эозином (ГЭ). Оценку окрашенных таким способом образцов провел независимый патологоанатом с опытом изучения образцов тканей, пораженных остеоартритом. Обнаруженные в суставах кроликов поражения суставного хряща оценили по шкале Малкина (15).
2.4. Биохимическая оценка
0,3 мл собранной синовиальной жидкости центрифугировали при скорости 5 000 об/мин в течение 30 минут. Уровни ИЛ-1в, ФНО-б и TIMP-1 определили с использованием набора для иммуноферментного (твердофазного) анализа (ИФА) (фирмы «Ксуанхао Сайенс энд Текнолоджи Девелопмент Ко., Лтд.», Шанхай, Китай). Уровни iNOS и NO в синовиальной жидкости определили с использованием наборов для обнаружения iNOS и NO (Наньцзинский институт биоинженерных технологий, Наньцзин, Джангсу, Китай).
2.5. Статистический анализ
Анализ полученных данных был проведен с использованием t-критерия. Значимыми считались значения p < 0,05.
3. Результаты
В Таблице 1 представлены результаты гистологического исследования, оцененные по шкале Малкина. В ходе гистологического исследования в контрольной группе и трех группах лечения были обнаружены разные уровни дегенеративных изменений. Между гистологическими показателями в группах «ГК» и «ХС-ГК» значительных различий не наблюдалось (p > 0,05), однако в двух указанных группах показатели были выше, чем в группе контроля (p < 0,01). В группе «ХС» гистологические показатели были незначительно выше таковых в группе контроля (p > 0,05).
Таблица 1. Оценка по шкале Малкина
Группы | Показатель по шкале Малкина |
Контроль | 8,25 ± 2,22 |
ГК | 5,50 ± 0,49* |
ХС | 6,33 ± 1,52 |
ХС-ГК | 5,17 ± 0,24* |
Как показано на рисунке 1A, структура нормальной синовиальной оболочки не повреждена, и эпителиальные клетки обычные и плоские. Как показано на рисунке 1B, в контрольной группе ламинация синовиальных оболочек исчезла. Некоторые эпителиальные клетки были отечные, с признаками гиалинового перерождения или пролиферации. Наблюдалась пролиферация мелких сосудов в синовиальной оболочке и очаговый ишемический некроз в синовиальной полости. Волокнистая соединительная ткань припухла, и большое количество капилляров расширились, наблюдалось явное воспаление. Как показано на рисунке 1C, у животных в группе «ХС» имеет место явная пролиферация синовиальных клеток. Утолщение синовиальной оболочки менее выражено по сравнению с контрольной группой. Наблюдались локальное покраснение, отек, инфильтрация большим количеством плазмоцитов и небольшим количеством лимфоцитов. Как показано на рисунке 1D, в группе «ГК» наблюдалась явная пролиферация синовиальных клеток и утолщение синовиальной оболочки. В группе «ГК» уровень пролиферации был выше, чем в группе «ХС». Кроме того, степень локального отека и застойных явлений была ниже, чем в группе «ХС». Наблюдалась незначительная гиперплазия кровеносных сосудов, и уровень восстановления кровотока был выше, чем в группе «ХС». Как показано на рисунке 1E, в группе «ХС-ГК», пролиферация эпителиальных клеток носила очаговый характер, при этом ткань сохранила нормальный вид. Уровень восстановления синовиальной оболочки был выше, чем в других группах. В целом, в группе «ХС-ГК» наблюдался высокий уровень восстановления синовиальной оболочки.
Как показано на рисунке 2A, нормальные хондроциты имеют округлую форму и равномерно распределены в хрящевой ткани. Склеротин имеет целостную форму, и структура ткани четкая. Как показано на рисунке 2B, в контрольной группе наблюдалось более интенсивное выравнивание хондроцитов в линию и более толстая прослойка фиброхряща. Были обнаружены явные признаки кариопикноза. Промежутки между лакунами увеличились, а клетки повреждены и растворились. В хрящевом матриксе имеются разрывы вдоль коллагеновых волокон. Как показано на рисунке 2C, в группе «ХС» количество хондроцитов увеличилось. Ядра некоторых хондроцитов сжались, вследствие чего увеличились промежутки между лакунами. Форма склеротина осталась неповрежденной, структура ткани четкая, и слои четко разделены. Как показано на рисунке 2D, в группе «ГК» хрящ имеет четкую структуру. Наблюдается явная пролиферация хондроцитов. Ядра некоторых хондроцитов сжались, вследствие чего увеличились промежутки между лакунами. Как показано на рисунке 2E, в группе «ХС-ГК», количество хондроцитов увеличилось. Ядра некоторых хондроцитов сжались, вследствие чего увеличились промежутки между лакунами. Форма склеротина осталась неповрежденной, структура ткани четкая, и слои четко разделены. Одним словом, в группах применения активных препаратов восстановление хрящевой ткани было более выраженным, чем в группе контроля, однако между тремя группами активного лечения не наблюдалось значительных различий.
В таблице 2 представлены результаты биохимической оценки. Полученные результаты указывают на то, что уровни экспрессии ИЛ-1в, ФНО-б, TIMP-1 и NO в синовиальной жидкости животных в группах активного лечения отличаются от таковых животных в контрольной группе (p < 0,05). Уровни экспрессии iNOS в синовиальной жидкости в группах «ХС-ГК» и «ХС» были ниже, чем в контрольной группе, указывая на то, что ХС способен ингибировать экспрессию iNOS. Уровень ИЛ-1в в синовиальной жидкости в группе «ХС-ГК» был намного ниже, чем в контрольной группе. Однако между тремя группами активного лечения не наблюдалось явных различий в уровне экспрессии биохимических молекул.
Рисунок 1. Окрашенные ГЭ патологические участки синовиальных оболочек, полученных у животных в разных группах. A, нормальная синовиальная оболочка (Ч200); B, контрольная группа (Ч200); C, группа «ХС» (Ч200); D, группа «ГК» (Ч200); E, группа «ХС-ГК» (Ч200).
Рисунок 2. Окрашенные ГЭ патологические участки хрящей, полученных у животных в разных группах. A, нормальный хрящ (Ч200); B, контрольная группа (Ч200); C, группа «ХС» (Ч200); D, группа «ГК» (Ч200); E, группа «ХС-ГК» (Ч200).
Таблица 2. Уровни экспрессии ИЛ-1в, ФНО-б, TIMP-1 и NO в разных группах лечения
Группы | ИЛ-1в (мкг/мл) | ФНО-б (мкг/мл) | TIMP-1 (нг/мл) | iNOS (Ед/мл) | NO (мкмоль/л) |
Контроль | 73,89 ± 5,29 | 66,20 ± 6,79 | 4,59 ± 0,38 | 22,85 ± 3,46 | 229,40 ± 43,86 |
ГК | 45,37 ± 5,09** | 51,35 ± 5,49* | 9,43 ± 1,20* | 16,58 ± 1,53* | 125,69 ± 22,00* |
СХ | 52,23 ± 2,68* | 48,92 ± 4,72* | 7,12 ± 0,97* | 16,63 ± 2,24* | 106,70 ± 10,29* |
СХ-ГК | 58,46 ± 5,50* | 47,54 ± 3,20* | 7,40 ± 0,63* | 16,63 ± 2,24* | 116,63 ± 18,37* |
4. Обсуждение
Симптоматические медленно действующие лекарственные средства против остеоартроза – это соединения, которые на протяжении многих лет использовались в Европейских странах в качестве лекарственных препаратов. В руководстве EULAR по лечению остеоартрита коленного сустава, опубликованном в 2003 году, ХС для приема внутрь указан как препарат с уровнем доказательности рекомендаций 1A и силой рекомендации A, что соответствует самому высокому уровню рекомендации терапевтической стратегии (16). Польза ХС в лечении остеоартрита обусловлена тремя основными механизмами действия: i) стимуляция выработки хондроцитов в межклеточном матриксе (МКМ) (протеогликан, ХС, гиалуронан); ii) подавление медиаторов воспаления (миелопироксидаза, N-ацетилглюкозаминидаза, коллагеназа, шиалуронидаза. эластаза), и iii) ингибирование перерождения хряща (17).
Тем не менее, польза ХС не принята всеми руководствами, и в настоящее время продолжают поступать противоречивые данные по модифицирующей эффективности препаратов на основе ХС (18). Результаты мета-анализа пяти плацебо-контролируемых РКИ свидетельствуют о том, что применение ХС может быть связано с менее значительной пользой, чем ожидалось (19).
В данном исследовании мы изучили воздействие инъекций ХС и ХС-ГК на остеоартрит у кроликов. После 5 внутрисуставных инъекций в группе применения комбинации ХС-ГК наблюдался самый высокий уровень восстановления синовиальной оболочки. Однако между показателями по шкале Малкина, полученными в группах «ХС-ГК» и «ГК» не наблюдалось явных различий, и показатели по шкале Малкина, полученные в группе «ХС», не отличались от таковых, полученных в группе контроля. Хотя в группах лечения уровни восстановления хрящевой ткани были выше, чем в контрольной группе, между тремя группами лечения не наблюдалось значительных различий. Полученные результаты указывают на то, что внутрисуставное введение комбинации ХС и ГК не обладает явным преимуществом по сравнению с рутинными внутрисуставными инъекциями ГК.
Как показано в таблице 2, уровни экспрессии таких воспалительных факторов, как ИЛ-1в, ФНО-б и TIMP-1 в синовиальной жидкости животных, получивших активное лечение, отличались от таковых в контрольной группе, указывая на то, что лечение остеоартрита при помощи внутрисуставных инъекций ГК, ХС или ХС-ГК ингибирует воспалительный процесс в суставах. Однако ингибирующее действие ХС и ХС-ГК на воспаление не превосходило таковое ГК. Повышенная экспрессия iNOS может повысить уровень NO и вызвать повреждение хряща у пациентов с остеоартритом (20). В ходе исследования нами было установлено, что инъекции ХС и ХС-ГК подавляют экспрессию iNOS. Однако между группами «ХС», «ГК» и «ХС-ГК» не наблюдалось значительных различий в уровнях NO.
Таким образом, в лечении остеоартрита инъекции ХС-ГК не обладают явным преимуществом перед инъекциями ГК.
Список литературы
1. Miyazaki T, Wada M, Kawahara H, Sato M, Baba H, Shimada S. Dynamic load at baseline can predict radiographic disease progression in medial compartment knee osteoarthritis. Ann Rheum Dis. 2002; 61:617-622.
2. Xu WD, Wu YS, Zhang CS. Diagnose and treatment of osteoarthritis. Second Military Medical University Press, Shanghai, China, 2004; pp. 61-63, 140-141.
3. Chen BC, Zhang J. Osteoarthritis. The People's Medical Publishing House, Beijing, China, 2004; pp. 1-3.
4. Greenberg DD, Stoker A, Kane S, Cockrell M, Cook JL. Biochemical effects of two different hyaluronic acid products in a co-culture model of osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 2006; 14:814-822.
5. Smith MD, Triantafillou S, Parker A, Youssef PP, Coleman M. Synovial membrane inflammation and cytokine production in patients with early osteoarthritis. J Rheumatol. 1997; 24:365-371.
6. Fiorito S, Magrini L, Adrey J, Mailhe D, Brouty-Boye D. Inflammatory status and cartilage regenerative potential of synovial fibroblasts from patients with osteoarthritis and chondropathy. Rheumatology (Oxford). 2005;44:164-171.
7. Volpi N. Chondroitin Sulfate: Structure, Role and Pharmacological Activity. Academic Press, Amsterdam/Boston/Heidelberg/London/New York/Oxford/Paris/San Diego/San Francisco/Singapore/Sydney /Tokyo, 2006.
8. Volpi N. Analytical aspects of pharmaceutical grade chondroitin sulfates. J Pharm Sci. 2007; 96:3168-3180.
9. Volpi N. Quality of different chondroitin sulfate preparations in relation to their therapeutic activity. J Pharm Pharmacol. 2009; 61:1271-1280.
10. Uebelhart D, Knols R, de Bruin ED, Verbruggen G. Treatment of knee osteoarthritis with oral chondroitin sulfate. Adv Pharmacol. 2006; 53:523-539.
11. Kahan A, Uebelhart D, De Vathaire F, Delmas PD, Reginster JY. Long-term effects of chondroitins 4 and 6 sulfate on knee osteoarthritis: The study on osteoarthritis progression prevention, a two-year, randomized, doubleblind, placebo-controlled trial. Arthritis Rheum. 2009;60:524-533.
12. lovu M, Dumais G, du Souich P. Anti-inflammatory activity of chondroitin sulfate. Osteoarthritis Cartilage. 2008; 16 (Suppl 3):S14-S18.
13. Mihara M, Higo S, Uchiyama Y, Tanabe K, Saito K. Different effects of high molecular weight sodium hyaluronate and NSAID on the progression of the cartilage degeneration in rabbit OA model. Osteoarthritis Cartilage. 2007; 15:543-549.
14. Ling PX, Zhang LN, Jin Y, He YL, Zhang TM. Effects of a hyaluronic acid and low molecular weight heparin injection on osteoarthritis in rabbits. Drug Discov Ther. 2009; 3:146-150.
15. Armstrong S, Read R, Ghosh P. The effects of intraarticular hyaluronan on cartilage and subchondral bone changes in an ovine model of early osteoarthritis. J Rheumatol. 1994; 21:680-688.
16. Jordan KM, Arden NK, Doherty M, et al. EULAR Recommendations 2003: An evidence based approach to the management of knee osteoarthritis: Report of a Task Force of the Standing Committee for International Clinical Studies Including Therapeutic Trials (ESCISIT). Ann Rheum Dis. 2003; 62:1145-1155.
17. Kubo M, Ando K, Mimura T, Matsusue Y, Mori K. Chondroitin sulfate for the treatment of hip and knee osteoarthritis: Current status and future trends. Life Sci. 2009; 85:477-483.
18. Zhang W, Moskowitz RW, Nuki G, et al. OARSI recommendations for the management of hip and knee osteoarthritis, part I: Critical appraisal of existing treatment guidelines and systematic review of current research evidence. Osteoarthritis Cartilage. 2007;15:981-1000.
19. Reichenbach S, Sterchi R, Scherer M, Trelle S, Bьrgi E, Bьrgi U, Dieppe PA, Jьni P. Meta-analysis: Chondroitin for osteoarthritis of the knee or hip. Ann Intern Med. 2007; 146:580-590.
20. Nemirovskiy OV, Radabaugh MR, Aggarwal P, Funckes-Shippy CL, Mnich SJ, Meyer DM, Sunyer T, Rodney Mathews W, Misko TP. Plasma 3-nitrotyrosine is a biomarker in animal models of arthritis: Pharmacological dissection of iNOS' role in disease. Nitric Oxide. 2009;20:150-156.
(Получено 06 февраля 2011 г.; Проверено 15 июня 2011 г.;
Повторно проверено 29 июня 2011 г.; Принято в печать 09 июля 2011 г.)
