Практическая работа №10
Динамика роста и размножения микроорганизмов.
Приготовление жидких питательных сред.
Цель работы: Изучить и проанализировать динамику роста микроорганизмов на примере дрожжей, требования к питательным средам, приготовление не агаризированых питательных сред с заданной величиной pH.
Оборудование: Микроскоп; камера Горяева, культура дрожжей, сахароза, NaOH, HCl, дист. Н2О, мерная посуда, круглодонные колбы, индикаторные полоски для определения pH, весы.
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
Питательные среды должны отвечать следующим требованиям:
содержать в достаточном количестве все необходимые питательные вещества, соли и ростовые факторы; иметь оптимальную рН, вязкость достаточную влажность; должны быть стерильными и по возможности прозрачными.По назначению питательные среды подразделяют на следующие основные категории:
- основные – предназначены для выращивания многих видов бактерий (мясо – пептонный бульон, мясо – пептонныйагар); элективные – способствующие развитию отдельных видов микробов (кровяные, сывороточные, яичные); селективные – подавляющие рост одних микроорганизмов и не влияющие на рост других (среды Мюллера, селенитовая, Рапопорт); дифференциально – диагностические – позволяющие отличать одни виды бактерий от других по их ферментативной активности или культуральным проявлениям (среды Эндо, Левина, Плоскирева, Гиса).
По консистенции питательные среды могут быть жидкими, плотными и полужидкими. Жидкие среды готовят на основе водных растворов каких – либо веществ, чаще всего мясной воды, различных гидролизатов, иногда естественных продуктов (молока, крови). Для получения плотных сред к ним добавляют агар – агар, который представляет собой полисахарид сложного состава, получаемый из морских водорослей. Агар – агар плавится при 100СО, но при охлаждении сохраняет жидкую консистенцию до 45СО. Для получения плотных сред его добавляют в концентрации 1,5 – 3,0 %. Полужидкие среды имеют вязкую консистенцию благодаря добавлению к ним небольшого количества агара (0,3 – 0,7 %).
Рост и размножение микроорганизмов.
Сложные процессы метаболизма, происходящие в клетке, отражаются такими явлениями как рост и размножение микроорганизмов. «Рост» означает увеличение массы клеток в результате синтеза клеточного материала. Интенсивность роста микроорганизмов можно определить делением их массы на численность особей в единице объема в отдельные промежутки времени. Рост индивидуальной клетки заканчивается размножением.
Под размножением микробов подразумевают способность их к самовоспроизведению, т. е. увеличению количества особей микробной популяции на единицу объема. Микроорганизмы характеризуются высокими темпами размножения: у бактерий -20 мин.; у дрожжей-30 - 90 мин.; у мицелиальных грибов - 5-6 часов. Однако в действительности такого быстрого размножения микробов не происходит, т. к. продолжительность периода размножения зависит от вида микроорганизма, возраста, характера среды, условий культивирования (температура, рН, накопившиеся метаболиты и др.).
Размножение микроорганизмов в ограниченном объеме жидкой питательной среды (в пробирке, колбе) происходит в определенной закономерности и представлено на рис. Эта кривая косвенно характеризует также и отмирание клеток, параллельно идущее с размножением клеток. На кривой размножения различают четыре основные последовательные фазы роста культуры:
-начальная фаза-лаг-фаза (фаза задержки роста);
-логарифмическая фаза - лог-фаза;
-стационарная фаза;
- фаза отмирания.
Лаг-фаза - период задержки роста микроорганизмов, в течение которого внесенные в питательную среду микробы адаптируются к питательной среде и начинают размножаться с нарастающей скоростью. Продолжительность лаг-фазы составляет 1-4 часа и зависит от видовых особенностей микроорганизмов, количества засеваемого материала, питательных веществ и др. В этой фазе размеры клеток в три-пять раз больше обычных, имеют большую биохимическую и энергетическую активность и отличаются повышенной чувствительностью к различным бактерицидным факторам.
Логарифмическая фаза характеризуется быстрым и постоянным размножением микробов. Количество клеток увеличивается в геометрической прогрессии. В этот период морфологические свойства типичны для данного вида, вся популяция однородна, устойчивость клеток к неблагоприятным факторам возрастает. Продолжительность этой фазы 5-8 часов. Для длительного нахождения микроорганизмов в этой фазе (в так называемой непрерывной культуре) в сосуд непрерывно вводят новые порции питательной среды и одновременно удаляют из него соответствующее количество микробной суспензии вместе с продуктами метаболизма.
Стационарная фаза завершает период роста культуры и продолжается 4-5 часов. Она характеризуется сбалансированным размножением и отмиранием микроорганизмов. Отмирание микроорганизмов происходит в результате истощения питательной среды и накопления продуктов обмена. В этой стадии наряду с типичными клетками встречаются дегенеративные и инволюционные формы.
Фаза отмирания (старение культуры) характеризуется массовой гибелью клеток, т. е. гибелью с постоянной скоростью через равные промежутки времени. Причиной отмирания клеток является изменение физико-химических свойств среды и лизис клеток под действием собственных ферментов. Микробы могут утрачивать подвижность, способность воспринимать окраску, у споровых видов наряду с отмиранием вегетативных клеток происходит образование спор, меняется биохимическая активность и т. д. Продолжительность фазы может составлять от 7-10 до 30 суток.
Описанные закономерности развития популяции будут правильными при выращивании в оптимальных условиях (состав среды, рН, температура).
Рост микроорганизмов в жидкой питательной среде может проявляться помутнением и изменением цвета среды, наличием или отсутствием пристеночного кольца и поверхностной пленки различного характера, наличием или отсутствием осадка.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
Порядок выполнения работы
В четыре круглодонные колбы объёмом 500 мл. налить 100 мл. дистиллированной воды, концентрацию сахарозы взять равной 4%, значение pH равное 3,5,7,9, для этого используем NaOH, HCl, индикаторные полоски.
В приготовленные среды вносим по 5 гр. Дрожжей, оставляем при комнатной температуре на 10 мин, затем помещаем в термостат при температуре 37 Со на 30 мин. После этого из каждой колбы производим забор 1 мл жидкой дрожжевой массы (необходимо минимизировать возможность забора пены для этого пипетку нужно погрузить на дно колбы), производим разбавление дистиллированной водой в 10 раз (если количество клеток в камере Горяева слишком большое то производим аналогичное разведение в 20, 30,40 раз и. т.д.) далее производим подсчет в камере Горяева, в 5 больших квадратах (т. е. в 80 малых) и заносим данные в формулу для подсчёта количества клеток. (чтобы найти a необходимо сумму клеток в 5 квадратах разделить на 80)
Где N – количество клеток
n – разведение исходной суспензии (10,102,103, и т. д.)
a – среднее количество клеток большом квадрате
h – глубина камеры (0,1 мм)
S – площадь квадрата сетки (Размеры малого квадрата камеры Горяева 0,05Ч0,05 мм)
Аналогичную работу необходимо производить до тех пор пока рост микроорганизмов не достигнет стационарной фазы. После этого строим линейный график, по оси y количество клеток, по оси x время. На графики необходимо нанести 4 кривые характерные для питательной среды с соответствующим pH.
Отчёт: В отчете делаем вывод о том, какая из питательных сред является наиболее оптимальной для размножения данных микроорганизмов.
Контрольные вопросы
Каковы основные требования к питательным средам?: Назовите основные категории питательных сред по назначению? Дайте определение всем фазам размножения микроорганизмов?Приложение 1.
