Исследование реакции бактериальной люминесценции под воздействием электромагнитного излучения миллиметрового и инфракрасного диапазонов

Публикация доступна для обсуждения в рамках функционирования постоянно

действующей интернет-конференции “Бутлеровские чтения”. http:///readings/

УДК 615.076.7+ 615.012.6+621.371. Поступила в редакцию 30 ноября 2013 г.

Исследование реакции бактериальной люминесценции

под воздействием электромагнитного излучения

миллиметрового и инфракрасного диапазонов

© Кузнецов1*+ Денис Бахтиерович, Одегова1* Татьяна Федоровна,

Несчисляев2* Валерий Александрович, Гейн1 Владимир Леонидович,

Лунегов3 Игорь Владимирович и 3

1 ГБОУ ВПО Пермская государственная фармацевтическая академия Минздрава России.

Ул. Полевая, 2. г. Пермь, 614990. Пермский край. Россия.

Тел.: [phone]. E-mail:denis. *****@***com

2 Филиал ФГУП «НПО «Микроген» Минздрава России «Пермское НПО «Биомед».

Ул. Братская, 177.  г. Пермь, 614089. Пермский край. Россия.

Тел.: [phone]. E-mail: *****@***com

3 ГБОУ ВПО Пермский государственный национальный исследовательский университет.

Ул. Букирева, 15, г. Пермь, 614068. Пермский край. Россия. Тел.: [phone].

_______________________________________________

*Ведущий направление; +Поддерживающий переписку

Ключевые слова: биолюминесценция, СВЧ-излучение, ИК-излучение, многослойная адсорбция, вода.

Аннотация

Показано, что воздействие электромагнитным излучением миллиметрового и инфракрасного диапазонов вызывает как стимулирующий, так и ингибирующий эффект в отношении биолюминес-ценции штамма Escherichia coli lum+. Проведено сравнительное изучение различных режимов воздействия электромагнитного излучения на реакции бактериального свечения. Выявлена высокая чувствительность биосенсора к излучениям. Установлены варианты оптимальных режимов излучения для активации биолюминесценции тест-штамма.

Введение

В последнее время возрос интерес к исследованиям и практическому использованию различных видов электромагнитных излучений в химии и химической технологии, в част-ности, при проведении реакций гетерогенного катализа (см. обзор [1]) и модификации поли-мерных материалов [2].

Известно, что СВЧ-излучение оказывает влияние на ионные группировки и перераспре-деление воды между гидратными и ион-ионными формами [3].

Исследования воздействия СВЧ-излучения на живые организмы показали, что оно может применяться как средство дебактеризации пищевых продуктов [4, 5].

Работы, посвященные исследованиям нетеплового воздействия СВЧ - и ИК-излучениям на микроорганизмы [6-8], показали, что в основе молекулярного механизма влияния на клетки лежит активация многослойной адсорбции молекул воды на гидрофильной поверхности за счет смещения деформации электронной плотности молекул и изменения дипольного мо-мента молекул.

При запуске процесса многослойной адсорбции происходит вытеснение ионов Н+ за пре-делы адсорбированных слоев в область с повышенной концентрацией Н+, таким образом, возникает градиент концентрации протонов (Дмн+), являющийся одним из трех конвертируе-мых форм энергии [9].

Экспериментальная часть

Материалы и методы.

Подготовка проб. Подготовка к проведению измерений включала регидратацию и приготовление рабочего разведения лиофилизированного индикаторного штамма люминесцентных бактерий (проба) E. coli lum+ с помощью воды очищенной имеющей рН 7.0±0.2 и охлажденной до температуры (6±2) °С. Затем разведенную индикаторную культуру выдерживали не менее 30 мин при температуре (22±2) °С.

Экспериментальные установки. В качестве объектов исследования выступали пробы, облучае-мые инфракрасным излучением с длиной волны л = 850-890 нм и СВЧ-излучением миллиметрового диапазона с л = 8.14; 4.9 и 5.6 мм.

Схема экспериментальной установки для СВЧ-облучения проб с длиной волны л = 8.14 мм показана на рис. 1.

Рис. 1. Схема установки для облучения проб на л = 8.14 мм

Источником излучения служил генератор Г4-156 на диоде Ганна 1, обеспечивающий генерацию плоскополяризованного излучения мощностью порядка 20 мВт в режиме непрерывной генерации. СВЧ-сигнал с выхода генератора через развязывающий ферритовый вентиль 2, аттенюатор 3, согла-сующий Е-Н трансформатор 4 поступал на рупорную СВЧ-антенну 5 с раскрывом прямоугольной формы 72Ч34 мм.

Линза 6 формировала пучок СВЧ-излучения (волна Н10) и направляла его на полимерную (поли-этиленовую) пробирку круглого сечения с пробой, установленную на пенопластовой подставке 7, проз-рачной для данного излучения. Вектор напряженности электрического поля был ориентирован вертикально. Сечение СВЧ-пучка на уровне половинной мощности и пробирка с пробой представлены в левой части рис. 1.

Суммарные потери энергии: потери в антенно-волноводном тракте, рассеяние за пределами сечения на уровне половинной мощности и отражение от поверхности полимерной пробирки состав-ляли порядка 30% генерируемой мощности, таким образом поток мощности СВЧ-излучения, воздей-ствовавший на исследуемую пробу, составлял порядка 0.4 мВт/см2. Расстояние от раскрыва антенны до центра пробирки составляло 38 см, что с учетом применения СВЧ-линзы обеспечивало работу в дальней волновой зоне антенны.

На рис. 2а изображена схема установки для облучения проб СВЧ-излучением с л = 5.6 мм и 4.9 мм. В качестве генератора 1 был использован аппарат МИЛТА-КВЧ НПО «Космического приборострое-ния» (Россия) с выходной мощностью 10 мВт. СВЧ-излучение (волна Н11) распространялось по волноводу круг-лого сечения 2 и в виде расходящейся волны облучало пробирку с пробой 3.

а)	б)
Рис. 2. Схема установки для облучения проб: а – СВЧ-излучением с л = 5.6 мм и 4,9 мм; б – ИК-излучением с л = 850-890 нм

Расстояние между раскрывом волновода и пробиркой было выбрано порядка 1 см, что с одной стороны обеспечивало работу в дальней зоне , где d – диаметр раскрыва волновода, для  л = 5.6 мм d = 4.5 мм и R = 7.2 мм; для л = 4.9 мм d = 4.0 мм и R = 6.5 мм, с другой стороны пробирка находилась внутри сечения СВЧ-пучка на уровне половинной мощности, которое по нашим расчетам составляло порядка 1 см.

Вектор напряженности электрического поля был ориентирован горизонтально. Внутри сече-ния СВЧ-пучка на уровне половинной мощности волна Н11 по структуре близка к волне Н10.

В качестве источника излучения ИК-диапазона использовался аппарат МИЛТА-Ф-8-01 НПО «Космического приборостроения» (Россия), включающий в себя ИК-лазер и ИК-светодиоды, работающие в диапазоне л = 850-890 нм.

Импульсная мощность излучения лазера составляла 21 Вт, а непрерывная мощность излучения светодиодов (4 шт) – 100 мВт. На рис. 2б представлена схема установка для облучения проб ИК-излучением, состоявшая из камеры 1 с размещенными в ней ИК-лазером 2 и светодиодами 3.

Пробирка с пробой размешалась внутри камеры 1 так, что дно прилегало к излучающей поверх-ности лазера и крепилась сверху на отражающей алюминиевой опоре 5.

Измерение биолюминисценции. Определение биолюминесценции под воздействием излучения в отношении энтеробактерий проводили с помощью экспресс-теста ингибирования биолюминесцен-ции индикаторного штамма Escherichia coli lum+ [10]. Уровень гашения (стимуляции) свечения инди-каторной культуры определяли с помощью люминометра Биотокс-10 -С» (Россия) через фиксированные промежутки времени после облучения: 10 мин, 1, 2, 3, 4, 5 и 24 ч. Эффект воз-действия излучения выражали в виде цифрового показателя ИАА=, где х1 и х2 – интенсивности свечения индикаторного штамма без и после облучения соответственно [10]. Обработку данных проводили с помощью программного обеспечения MS Excel.

Результаты и их обсуждение

1. Эксперименты по воздействию СВЧ и лазерного ИК-излучения

на биолюминисценцию тест-штамма

При проведении биолюминесцентного теста было выявлено несколько вариантов развития реакции ингибирования и/или стимулирования свечения индикаторного штамма E. coli lum+ после воздействия на него электро-магнитного излучения (ЭМИ) (рис. 3-5).

Установлено, что СВЧ-излучение сразу повышает люминесценцию сенсора, особенно на л = 4.9 мм более 80% (рис. 3). При использовании лазерного ИК-излучения после кратко-срочного периода начального ингибирования (85% при 10 мин экспозиции (рис. 7), 17% на частоте лазера 0.6 и 5 кГц, 7% в режиме без модуляции при 5 мин экспозиции (рис. 6) и 9.5% при 2 мин, 0.6 кГц (рис. 5)) наступала фаза стимуляции свечения сенсора.

Рис. 3. Влияние СВЧ-излучения на биолюминесценцию E. coli lum+. Время экспозиции 60 мин.

При двухминутном облучении пробы немодулированным лазерным излучением на-блюдались незначительные изменения в свечении относительно контрольного образца (рис. 5), аналогичная картина была и при облучении пробы в течение часа СВЧ-излучением на л = 8.14 мм (рис. 4).

При уменьшении времени экспозиции до 20 мин при облучении на л = 8.14 мм уровень биолюминисценции значительно увеличился через 5 часов.

При облучении образца в течение 10 мин модулированным лазерным излучением наблюдаются два максимума свечения, с величиной ИАА = -41 и -33.5 (рис. 7).

При экспозиции в течение 5 мин также наблюдаются два максимума ИАА = -40.5 и -27.3 (штрихпунктирная линия на рис. 6) без модуляции и ИАА = -7.6 и -41.2 на частоте модуляции лазера 0.6 кГц (сплошная линия на рис. 6) и ИАА = -15.6 и -33.5 на 5 кГц (пунктирная линия на рис. 6).

Рис. 4. Влияние СВЧ-излучения на биолюминесценцию E. coli lum+. Время экспозиции 60 мин, длина волны 8.14 мм.

Рис. 5. Влияние ИК-излучения на биолюминесценцию E. coli lum+. Время экспозиции 2 мин.

Рис. 6. Влияние ИК-излучения на биолюминесценцию E. coli lum+. Время экспозиции 5 мин.

Рис. 7. Влияние ИК-излучения на биолюминесценцию E. coli lum+. Время экспозиции 10 мин.

При 2-х минутной экспозиции с частотой модуляции лазерного излучения 5 кГц наб-людается один максимум ИАА  = -64.(пунктирная линия на рис. 5).

В опыте с СВЧ-излучением на л = 4.9 мм уровень свечения в течение первых 3-х часов монотонно снижался до ИАА = -33, а затем оставался постоянным.

На л = 5.6 мм в течение первых 2-х частов наблюдалось незначительное снижение ИАА, которое затем монотонно повышалось до ИАА = -55, спустя 24 ч после экспозиции (рис. 3).

Влияние ИК - и СВЧ-излучения на штамм E. coli lum+ на протяжении первых часов экс-позиции было различным – после воздействия ИК-излучением наблюдалось вначале ингиби-рование или соответствие ИАА контрольного образца, а при воздействии СВЧ-излучением имела место стимуляция свечения.

Было показано, что после 24 ч пробы, обработанные ИК-излучением сохраняли стиму-ляцию свечения, аналогичное явление наблюдалось и после воздействия СВЧ-излучения с л = 4.9 и 5.6 мм (рис. 3).

СВЧ-излучение с л = 8.14 мм с временем экспозиции 60 мин, приводило к спаду интен-сивности свечения до уровня контрольного образца (рис. 4).

2. Обсуждение воздействия модуляции лазерного ИК-излучения

на биолюминисценцию тест-штамма

Согласно полученным данным по влиянию лазерного ИК-излучения с различной часто-той модуляции совместно с некогерентным ИК-излучением светодиодов на уровень биолюми-несценции можно констатировать, что молекулы-акцепторы пробы имеют порог насыщения, после которого наступает точка бифуркации.

Различные порции энергии, сообщаемые молекулам-акцепторам, в зависимости от час-тоты модуляции, приводят к различным эффектам.

Причем, чем меньше время облучения, тем больше должна быть частота модуляции, чтобы добиться стимуляции люминесценции и наоборот, чем больше время экспозиции, тем частота модуляции должна быть меньше (рис. 5-7).

Взаимодействие системы с внешним излучением ИК-диапазона (взаимодействие эндо-генных и экзогенных флуктуаций), ее погружение в неравновесные условия может стать исходным пунктом в формировании новых динамических состояний – диссипативных структур.

Диссипативная структура отвечает форме супермолекулярной организации, возникаю-щей в результате коллективных взаимодействий элементов системы (молекул).

При заданных граничных условиях в сильно нелинейной системе могут существовать не одно, а несколько стационарных состояний. Переход из одного состояния в другое играет важную роль в механизмах управления, встречающихся в биологических системах.

Нативные среды представляют собой молекулы воды в граничных условиях нелинейной сильно неравновесной системы и могут находиться в нескольких состояниях (стабильных и метастабильных), крайние из которых можно условно обозначить: НОНn (некогерентное) и НОН*n (когерентное).

При этом условие неравновесности состояний является источником организации мате-рии [11].

В проведенных экспериментах с люминесцентным тест-штаммом диссипативными структурами выступали адсорбированные слои воды на гидрофильной поверхности как б-спи-рали люциферазы и других гидрофильных поверхностей.

3. Обсуждение воздействия ЭМИ с различной длиной волны

в миллиметровом СВЧ-диапазоне на люминесценцию

Анализ динамики биолюминесценции тест-штамма после различных влияний ЭМИ поз-воляет сделать вывод о его значительном адаптационном потенциале и о специфичности раз-вития реакции стимуляции, обусловленной временем, длиной волны и режимами излучения.

Сопоставляя полученные результаты, следует отметить наибольшую чувствительность тест-штамма к СВЧ-излучению на л = 4.9 и 5.6 мм с экспозицией 60 мин и ИК-излучению с  2-х минутной экспозицией при частоте модуляции лазерного излучения 5 кГц и 5-ти минут-ной в режиме непрерывной генерации.

Анализ полученных результатов позволяет сделать вывод о том, что воздействие СВЧ - и ИК-излучения на биолюминисценцию связано с избирательным поглощением электромагнит-ного излучения. Низкоэнергетические внешние воздействия существенно влияют на биохи-мические процессы, включая весь энергетический обмен микроорганизмов в целом.

При этом происходят молекулярные структурные перестройки, связанные с перераспре-делением электронной плотности молекул-акцепторов, сопровождающиеся каскадными реакциями с накоплением ионов Н+ в «кислотных резервуарах» путем вытеснения из адсор-бированных слоев молекул воды на гидрофильных поверхностях. На рис. 8 показано как под воздействием квантов ЭМИ hн1 на б-спирали белковых молекул происходит усиленная адсорбция молекул воды (выноска в увеличенном масштабе). В результате образуются многослойные надмолекулярные комплексы, при этом происходит диссоциация части моле-кул воды, сопровождающаяся вытеснением протонов с образованием градиента их концент-рации Дмн+. Энергия ЭМИ переходит в энергию диполь-дипольного взаимодействия и накап-ливается в адсорбированных слоях воды и в градиенте Дмн+. Вытесненные протоны восста-навливают FMN (структурная формула приведена в правом верхнем углу рис. 8) до FMNH2. Затем FMNH2 отдает протон и два электрона через переносчик люмиредоксин, восстанавливая цитохром Р-450 (на рисунке не показаны). При этом выделяющаяся избыточная энергия уносится квантами светового излучения hн2.

Рис. 8. Механизм воздействия ЭМИ на биолюминесценцию

Предложенный механизм объясняет длительное сохранение эффекта воздействия ЭМИ на реакцию люминесценции. Однако данное предположение требует дополнительной про-верки.

Заключение

Полученные в настоящем исследовании результаты согласуются с результатами других авторов и свидетельствуют о целесообразности исследований по использованию СВЧ - и ИК-излучений при проведении технологических процессов на биофармацевтическом производстве.

Выводы

Миллиметровое (4.9; 5.6; 8.14 мм) и лазерное инфракрасное (л = 850-890 нм) нетепловые излучения оказывают выраженный стимулирующий эффект на люминесценцию сенсора – индикатор-ного штамма E. coli lum+ . Влияние данных электро-магнитных излучений носит пролонгированный характер.
Время облучения (2, 5 и 10 мин) ИК-излучением и частота импульсного режима лазерного излучения (режим непрерывной генерации, и модуляции с частотой 0.6 кГц, 5 кГц) раз-лично влияют на биолюминесценцию тест-штамма – E. coli lum+.
В первый час после облучения тест-штамма – E. coli lum+ лазерным ИК-излучением (л = 850-890 нм) на 5 и 10 мин экспозиции наблюдается ингибирование люминесценции, которое постепенно переходит в стимуляцию.
Для увеличения стимуляции люминесценции тест-штамма – E. coli lum+ лазерным ИК-излучением (л = 850-890 нм) при меньшем (чем 5 мин) времени экспозиции требуется большая частота лазерной модуляции, и наоборот, чем больше времени экспозиции, тем меньше нужна частота его модуляции.

Благодарности

Исследовательский коллектив выражает благодарность Директору Филиала ФГУП «НПО «Микроген» Минздрава России «Пермское НПО «Биомед» за предоставленную воз-можность проведения научно-исследовательских работ на базе НПО «Биомед», а также Ректорам ГБОУ ВПО ПГФА и ГБОУ ВПО ПГНИУ за предоставленное обору-дование.

Литература

, , Исследование физико-механических свойств полимерных материалов, модифицированных в электромагнитном поле СВЧ-диапазона. Бутлеровские сообщения. 2011. Т.24. №1. С.95-98. , , Применение электромагнитного излучения СВЧ диапазона в химической технологии. Бутлеровские сообщения. 2009. Т.18. №8. С.1-28. Молекулярные механизмы воздействия инфракрасного излучения на микроорганизмы. Фундаментальные исследования. 2013. №4. Ч.2. C.414-418. Перспективы применения электромагнитных излучений крайне высокой частоты малой мощности в фармации. Фундаментальные исследования. 2012. №10. Ч.2. С.400-404. Физико-химические механизмы воздействия крайне-высокочастотного излучения на микроорганизмы. Современные проблемы науки и образования. 2013. №1; URL: http://www. science-education. ru/107-8226 (дата обращения: 28.01.2013). , , Способ определения антагонистической активности пробиотиков. Патент на изобретение г. Заявка № 000. Приоритет № 000/14 от 10.07.00 г. Бюл. № 23. тенгерс И. «Порядок из хаоса» Новый диалог человека с природой. Перевод с английского под редакцией М.: Прогресс. 1986. 432с. , , Исследование воздействия СВЧ электромагнитного поля на микрофлору и насекомых какао-порошка. Бутлеровские сообщения. 2012. Т.31. №8. С.79-82. , ,  , Физические способы дебактеризации какао-бобов и какао-порошка. Бутлеровские сообщения. 2012. Т.31. №8. С.83-85. , Молекулярные преобразователи энергии живой клетки. Протонная АТФ-синтаза – вращающийся молекулярный мотор УФН 180. 2010. С.931-956. , Сравнение диэлектрических характеристик водных и водно-формамидных растворов нитратов калия и натрия в диапазоне СВЧ. Бутлеровские сообщения. 2011. Т.27. №14. С.74-80.