Выявление фальсификации меда путем определения содержания 5-гидроксиметилфурфурола

Выявление фальсификации меда путем определения содержания 5-гидроксиметилфурфурола

© 1*+, 1, 1, 1,

2

1Кафедра аналитической химии. Белорусский Государственный Университет.

Ул. Ленинградская, 14. г. Минск, 220030. Беларусь.

2Кафедра экспертизы в допинг - и наркоконтроле. Российский химико-технологический университет имени . Пл. Миусская, 9. г. Москва, 125047. Россия.

Тел.: [phone]. E-mail: *****@***com

Ключевые слова: мед, 5-гидроксиметилфурфурол, высокоэффективная жидкостная хроматография, газовая хроматография-масс-спектрометрия.

Аннотация

В данной статье была предложена методика выявления фальсификации меда путем определения содержания 5-гидроксиметилфурфурола. Методика включает в себя синтез стандарта 5-ГМФ, пробоподготовку проб меда, а также последующий хроматографический анализ методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в соответствии с предложенными условиями хроматографирования. Качество стандарта было подтверждено методом газовой хроматографии-масс-спектрометрии. Также приведена сравнительная характеристика классических методов определения 5-ГМФ в меде, которая подтверждает большую эффективность  использования ВЭЖХ в качестве основного метода для выявления фальсификации меда. На основании полученных данных была составлена метрологическая характеристика данного метода.

Введение

В настоящее время оценка качества натурального пчелиного мёда проводится в соответствии с требованиями государственных стандартов, которые распространяются на мёд, заготовляемый и реализуемый в различных торговых предприятиях всех форм собственности. При этом оцениваются как органолептические, так и физико-химические показатели качества мёда.

Целью настоящего исследования являлась разработка методологии и методик качественного и количественного определения 5-гидроксиметилфурфурола (ГМФ) в меде с использованием приемов высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и хромато-масс-спектрального анализа (ГХ-МС), и сопоставление результатов, полученных этими методами, с результатами существующих классических методов обнаружения. Также методом ВЭЖХ был проведен анализ углеводного состава различных образцов меда.

Установление количественного содержания ГМФ является одним из важнейших показателей натуральности меда, степени сохранности его природных качеств, позволяющее надежно контролировать технологию обработки меда, включающую нагревание, продолжительность и условия хранения меда. Данный компонент всегда присутствует в искусственно инвертированном сахаре.

Согласно европейским стандартам содержание ГМФ в меде не должно превышать 40 мг/кг. В соответствии с отечественным стандартом концентрация ГМФ ограничена концентрацией 25 мг/кг.

ГМФ образуется из углеводов, содержание которых в меде достигает 80%, либо при его длительном хранении, либо при перегревании. Присутствие ГМФ в пищевых продуктах нежелательно, поскольку фурановые производные являются ядами, которые при нахождении в малых дозах угнетают нервную систему, а в случае их присутствия в больших дозах вызывают судороги, паралич.

Классическими методами обнаружения ГМФ в образцах меда являются следующие: качественная реакция Селиванова-Фиге, спектрофотометрическое определение по Уайту и колориметрическое определение по Винклеру [1].

Поскольку степень достоверности эксперимента во многом определяется характеристиками чистоты используемых стандартов, для получения стандарта ГМФ высокой степени чистоты, нами был выполнен его синтез из сахарозы, по методике приведенной в [2]. Контроль чистоты стандарта ГМФ осуществлялся с использованием приемов ГХ-МС.

Экспериментальная часть

1.1 Реагенты и оборудование

Жидкостный хроматограф Shimadzu VP-Series, комплектованный; УФ-детектор, оснащенный дейтериевой лампой для детектирования в области 190-370 нм с шагом 1 нм; Колонка Hypersil BDS-C18, 3 Ч 125 мм, 3 мкм; Стандарт ГМФ; Микрофильтр мембранный целлюлозный 0.20 мкм; Ацетонитрил и вода для ВЭЖХ.

1.2 Условия хроматографического анализа

Для выполнения анализа были установлены следующие оптимальные условия хроматографирования, приведенные в табл. 1.

Таблица 1

Условия хроматографирования

Параметр	Характеристика
Элюирование	Градиентное
Подвижная фаза	Смесь ацетонитрил/вода
Детектор (область детектирования)	УФ (284 нм)
Скорость потока элюента	0.2 мл/мин
Объем вводимой пробы	20 мкл
Петля инжектора	10 мкл

1.3 Пробоподготовка и проведение анализа.

(1.000±0.001) г предварительно размягченного меда растворяют в 25 см3 дистиллированной воды и количественно переносят в мерную колбу объемом 50 см3, перемешивают до полного растворения. Далее добавляют по 10 мкл каждого из реактивов Карреза (1М растворы K4[Fe(CN)6] и Zn(CH3COOH)2), перемешивают и доводят дистиллированной водой до метки. Затем раствор фильтруют через целлюлозный микрофильтр с диаметром пор 0.20 мкм.

ГМФ был синтезирован из сахарозы согласно источнику. Синтез ГМФ проводили в термостатированной колбе конверсией 0.5 М водного раствора сахарозы в присутствии гидросульфата натрия (3.5 М) в качестве катализатора при 90 ˚С. Нагревание вели в течение 1 ч,  после чего реакционную массу нейтрализовали до рН 7 гидрокарбонатом натрия, отфильтровывали от нерастворимых гуминов и трижды экстрагировали этилацетатом. Из полученного экстракта отгоняли растворитель и получали кристаллизующийся при охлаждении 5-ГМФ достаточной степени чистоты [3]. Также был проведен анализ с использованием купленного стандарта ГМФ, результаты которого были неотличимы от опыта с синтезированным стандартом, что косвенно свидетельствует о достаточной чистоте полученного образца ГМФ.

С помощью ГХ-МС для синтезированного вещества были получены масс-спектр и хроматограмма, которые подтверждают, что данное вещество может быть использовано в качестве стандарта. Имеющееся программное обеспечение позволило установить с 98 % вероятностью синтезированное вещество, что позволило не использовать дополнительно этот же стандарт для газохроматографических определений.

Рис. 1. Хроматограмма 1 (слева) контрольного образца меда без добавки 5-гидрокси-метилфурфурола, подготовленного по описанной выше методике. Хроматограмма 2 (справа) контрольного образца меда с добавкой 10 мкг 5-гидроксиметилфурфурола, подготовленного по описанной выше методике.

На следующем этапе исследования проводился качественный и количественный анализы образцов меда с помощью метода ВЭЖХ на содержание ГМФ. Анализ проводился в указанных выше оптимальных условиях, а содержание искомого вещества было установлено с использованием метода добавки (рис.1).

Продолжительность анализа – 20 минут. После анализа колонка промывается элюентом с большим содержанием ацетонитрила в течение 15-20 минут.

Результаты и их обсуждение

С помощью полученных результатов, нами была составлена метрологическая характеристика метода, которая будет представлена позднее, в выводе. Помимо хроматографического анализа нами был выполнен анализ классическими методами. Теперь обсудим плюсы и минусы данных методов.

Качественная реакция Селиванова-Фиге основана на реакции резорцина с эфирными вытяжками меда, в результате чего мы наблюдаем характерное окрашивание. К минусам данного метода относится то, что помимо 5-ГМФ в реакцию с резорцином могут вступать многие другие альдегиды, в том числе и редуцирующие сахара. В результате получаются завышенные результаты, а побочные оттенки зачастую затрудняют выявление цвета. К плюсам можно отнести то, что этот метод не требует использования дорогостоящего оборудования.

Спектрофотометрический метод Уайта и колориметрический метод Винклера являются оптическими методами анализа. Подготовка пробы меда в данных случаях ведется таким же образом, что и в случае с анализа на ВЭЖХ. Несмотря на их относительную простоту, анализ методом высокоэффективной жидкостной хроматографии дает лучшую экспрессность и воспроизводимость данных [4].

Выводы

В результате выполнения данного исследования установлены оптимальные условия пробоподготовки и проведения хроматографических определений, выполнен анализ большого числа различных образцов меда. Установлена большая эффективность и экспрессность разработанных методик по сравнению с классическими. На основании полученных данных была приведена метрологическая характеристика метода (табл. 2), свидетельствующая о том, что данная методика может быть использована для выявления фальсификатов меда.

Таблица 2

Метрологическая характеристика метода

Анализируемый объект	Метрологические параметры, P = 0.95, n = 5
Предел обнаружения, мг/кг	Среднее значение определения, %	Стандартное отклонение, %	Доверительный интервал
ГМФ	0.01	87.4	3.5	± 3.1

Подводя итоги стоит сказать о перспективах дальнейшей работы. Полученная методика является началом составления методологии по выявлению фальсификации медовой продукции по многим параметрам. Разработка простых и эффективных методик пробоподготовки пчеловодческой продукции, а также разработка хроматографических методов определения качества меда с целью увеличения эффективности установления  подлинности данного продукта, и последующее внедрение данных методик в экспертные органы будет способствовать повышению качества распространяемой продукции.

Литература

Экспертиза меда и способы обнаружения его фальсификации. М.: Дашков и К. 2006. 142с. , , Определение 5-гидроксиметилфурфурола в образцах меда хроматографическими методами. Аналитика РБ-2012: Тез. докл. Междунар. конф. Минск. 2012. С. 10. Низкотемпературный синтез 5-гидроксиметилфурфурола. Химия растительного сырья. 2011. №1. С. 87-92. Wunderlin D. A., Pesce S. S., Ame M. V., Faye P. F. Decomposition of Hydroxymethylfurfural in Solution and Protective Effect of Fructose. J. Agric. Food Chem. 1998. Vol.  46 . P 1855-1863.

Finding Of Honey Adulteration By Means Of Determination Of 5-hydroxymethylfurfural Presence

Nalivayko P. A., Yurchenko R. A., Vinarski V. A., Alshakova I. D., Gladyrev V. V.

Department of Analitycal Chemistry. Belarusian State University. Leningradskaya str., 14. Minsk, 220030, Belarus. Phone: [phone]. E-mail: *****@***com

Key words: honey, 5-hydroxymethylfurfural, high performance liquid chromatography, gas chromatography-mass-spectrometry.

Abstract

Method of finding of honey adulteration by means of determination of 5-hydroxymethylfurfural presence was proposed in this article. Method includes synthesis of standart of 5-HMF, sample preparation of honey samples and following chromatographic analysis by means of high performance liquid chromatography accordingly to proposed conditions. The quality of synthesized standard was confirmed by gas parative characteristics of classical methods of determination of 5-HMF in homey samples that was introduced in this article confirm higher efficiency HPLC analysis as primary method of determination of adulteration of honey samples.