Вопросы

Основные правила поведения в бактериологической лаборатории Правила забора материала для микробиологических исследования Правила забора материала, хранения и транспортировке при ООИ Составить направление на микробиологическое исследование Дезинфекция в микробиологической лаборатории Подготовка посуды к стерилизации Этапы приготовления мазка Основные правила микросколия(микроскопия готовых препаратов) Окраска мазка по Циль-Нильсену Определение подвижности микроорганизмов метолом «раздавленной капли» Этапы приготовления питательных сред Правила посева на жидкие питательные среды Правила посева на плотные питательные среды Методы культивирования анаэробов Выделение чистой культуры аэробов Выделение чистой культуры анаэробов Заражение куриного эмбриона Окраска мазка по Граму

1.

1. В помещение лаборатории нельзя входить без специальной одежды: халата, тапочек, сменной обуви,

2. В лабораторию нельзя вносить посторонние вещи, запрещается курить и приносить пищу.

3. При распаковывании заразного материала необходимо соблюдать осторожность: пробирки снаружи обтирать дезинфицирующим раствором: переливание жидкостей, содержащих патогенные микробы, производят над сосудом, содержащим дезинфицирующий раствор.

4. Если разбилась посуда. Содержащая заразный материал (пробирка, чашка Петри), немедленно производится обеззараживание предметов, ©дежды, стола и помещения.

5. После окончания работы дезинфицируют руки и поверхность рабочего стола.

6. Музейные культуры микробов ставят на хранение в холодильник, закрывают и опечатывают.

7. Работники лаборатории подлежат обязательной вакцинации против тех инфекционных болезней, с возбудителями которых они работают. На кафедре микробиологии используются материалы, содержащие возбудителей III-IV групп, после разрешения председателя режимной комиссии Республиканской ГЭС.

2.

При заборе и работе с клиническим материалом персонал должен исполь­зовать перчатки и халат. Сроки доставки клинического материала в лаборато­рию должны быть сокращены до минимума.

Кровь для посева следует брать до начала антибактериальной терапии; на высоте подъема температуры; у постели больного с соблюдением правил асеп­тики. Посев производится в двойную и тиогликолевую среду в соотношении 1:10.

Моча для посева берется до начала антибактериальной терапии. Моча здо­рового человека стерильна. От начала взятия пробы мочи до начала исследова­ния в лаборатории должно проходить не более 1-2 часов.

Гной получают с помощью стерильного шприца или стерильного ватного тампона.

Испражнения на патогенные энтеробактерии берут ректальными петлями, смоченными консервантом, и помещают в пробирку с консервирующей средой.

Слизь из носоглотки (на дифтерию) забирают стерильным тампоном натощак. Тампон помещают в стерильную пробирку и доставляют в лабораторию не позже 2-3 часов с момента забора материала.

Спинно-мозговую жидкость получают в результате люмбальной пунк­ции. 3-5 мл ликвора помещают в пробирку (при транспортировке предохранять от охлаждения).

Мокроту собирают натощак после ополаскивания рта в стерильную посуду

3.

К особо опасным инфекциям прежде всего относится чума. При постанов­ке предварительного диагноза «чума» в лаборатории проводятся срочные мероприятия:

1. Немедленно сообщают 8 вышестоящие органы здравоохранения,

2. На лабораторию накладывается карантин, т. е. ни один лабораторный работник, контактировавший с заразным материалом, не должен покидать поме­щения лаборатории до прибытия эпидемиолога.

3. Все материалы: от больных, чистые культуры и павшие животные долж­ны быть направлены в специализированные лаборатории для окончательного установления диагноза.

Меры безопасности при транспортировке

Материал помещают в банки с плотно закрывающейся пробкой, обвязы­вают пергаментом(т. е. водонепроницаемым материалом), затем обвертывают салфетками, смоченными 5% раствором лизола или фенола. В таком виде банки с материалом помещают в металлические биксы. На банки с материалом на­клеивают этикетки. Все надписи на этикетке делают простым графитным ка­рандашом, г. к. надписи чернилами смываются при дезинфекционной обработ­ке.

4. После отправки материала проводят заключительную дезинфекцию.

Культуру автоклавируют при температуре 120 ЯС в течение 1 часа.

Стеклянную лабораторную посуду обеззараживают в 3% растворе хлора­мина или карболовой кислоты 1 сутки, а затем кипятят в 1% растворе бикарбо­ната натрия.

Трупы животных автоклавируют, заливают 10% раствором лизола на сутки и закалывают в специально вырытую яму.

Кожу открытых частей тела обрабатывают 70% раствором спирта.

4

. Направление на исследование является сопроводительным документом, который прилагается к инфекционному материалу, предназначенному для лабораторных исследовании.

Составляется по следующей форме:

1. название материала

2. учреждение, направляющее материал

3. фамилия, имя отчество больного

4. возраст

5. адрес больного

6. дата заболевания

7. дата взятия материала

8. предполагаемый клинический диагноз

9. подпись врача, направляющего материал

Поступивший в лабораторию инфекционный материал регистрируется в специальном журнале.

5.

Дезинфекция - это обеззараживание объектов окружающей среды с по­мощью химических веществ, обладающих антимикробным действием.

Цель дезинфекции - предупредить передачу возбудителей от инфициро­ванного организма неинфицированному.

В микробиологический лаборатории используют:

1. хлорную известь (0,1 — 10% раствор);

2. хлорамин (0.5 -5% раствор), для дезинфекции рук 0,25 — 0,5% раствор, для дезинфекции предметов ухода за больными при кишечных и воздушно-капельных инфекциях 1-3% раствор, при туберкулезе — 5% раствор;

3. фенол (карболовая кислота) в виде 3 — 5% раствора для дезинфекции по­мещений;

4. лизол (3 — 5% раствор);

5. биглюконат хлоргексидина (гибитан), для дезинфекции рук 0,5% рас­твор, для дезинфекции помещений 0,1% раствор;

6. дихлорид ртути (сулема) — иногда используют для дезинфекции предме­те ухода за больными. Препарат высокотоксичен, всасывается через кожу.

6.

В бактериологических и вирусологических лабораториях используют обычную лабораторную посуду: цилиндры, колбы, склянки для растворения и хранения реактивов, химические пробирки. Помимо этого используют специ­альную посуду:

Пробирки

• биологические - с крупным дном, неразвернутым краем;

• центрифужные - сужены книзу, конической формы;

• преципитацию иные - очень узкие с внутренним диаметром 2-3 мм Стеклянные чашки Петри для выращивания микроорганизмов на плотных питательных средах. Их изготавливают из прозрачного стекла, не имеюще­го камней, пузырей. Высота чашки 20-30 мм, диаметр 60-200 мм

Пипетки

• градуированные должны соответствовать параметрам ГОСТа

• пастеровские - стеклянные трубки диаметром 5-7 мм, у которых один конец оттянут над пламенем горелки в виде капилляра

Специальная лабораторная посуда должна быть чистой и стерильной. Мытье производят ершами с мылом и содой. Новую посуду следует до мытья прокипятить в 1-2% растворе хлористоводородной кислоты. Сушат посуду в су­шильном шкафу

Сухую посуду закрывают и помещают в пеналы. В пробирки вставляют ватные пробки и заворачивают в пачки по 5-10 штук. К чашкам Петри подбирают крышки и завертывают по одной или несколько штук. Пипетки закрывают ваткой с того конца, который берут в руки. Готовые пипетки заворачивают в бумагу и укладывают в пеналы. Стерилизация проводится в сухожаровом шкафу при температуре 180°С в течение 1 часа.

7.

Для приготовления мазка необходимо иметь:

• Чистое обезжиренное предметное стекло.
• Бактериологическую петлю
• Культуру, выращенную на плотной питательной среде — агаре, или жидкой среде — бульоне.
• Спиртовку.
• Набор красок.

1. Обезжиренное предметное стекло и бактериологическую петлю прожигают в пламени горелки. Пробирку с изучаемой культурой держат между указательным и большим пальцами левой руки. Петлю берут правой рукой, мизинцем правой руки прижимают пробку пробирки к ладони.

Если мазок готовится с жидкой питательной среды, то каплю культуры на­носят петлей на предметное стекло.

Если мазок делают из культуры с агара, то петлю с культурой вносят на предметное стекло и добавляют каплю физиологического раствора, в котором эмульгируют внесенный материал.

Петлю обжигают в пламени горелки. Мазок должен быть тонким, рав­номерно растертым, округлой формы, размером 1,5-2 см.

2. Высушивание мазка производится при комнатной температуре.

3. Фиксация мазка производится с целью:

• Убить микробные клетки.
• Обеспечить лучшее прилипание микробов к предметному стеклу.
• Облегчить дальнейшее окрашивание.

Фиксация мазка в пламени горелки производится 3-кратно, действие пла­мени должно длиться 2 секунды.

Для более нежной фиксации мазков крови, спирохет и простейших использующих химические фиксаторы:

• Метиловый спирт в течении 5-и минут.
• Этиловый спирт (96°) в течении 10-и минут.
• Смесь Никифорова — в течении 10-15 минут.
• Ацетон — в течении 5-и минут.
• Пары формалина — в течении нескольких секунд.

4. Окраска препаратов проводится:

• Простыми методами (водным фуксином Пфейффера, метиленовой синькой Леффлера), когда окрашивается вся клетка и используется только один краситель;
• Сложными методам, когда определяются клеточные структуры,

После экспозиции мазок промывают водой, высушивают фильтроваль­ной бумагой и микроскопируют под иммерсией.

8.

Световой микроскоп — это обязательная принадлежность любой микробиологической лаборатории. Разрешающая способность светового микроскопа 0,2 мкм. Общее увеличение микроскопа определяется произведением объекта на увеличение окуляра.

Микроскопия с сухими объективами дает увеличение в 120-600 раз. Не­достаток: часть лучей отклоняется в сторону и не достигается

хорошее освещение изучаемого объекта. Иммерсионные объективы — это объективы, которые погружают в жидкости (кедровое масло, персиковое мас­ло). Поскольку показатели преломления стекла и иммерсионного масла практи­чески одинаковы 1,52 , сохраняется четкость и ясность поля зрения. Полезное увеличение микроскопа достигает 2000 раз. Современный микроскоп — это точ­ный оптический прибор, поэтому необходимо строго соблюдать ряд правил при работе с ним:

1) использовать правильное освещение;

2) хранить закрытым от пыли;

3) для чистки оптических частей применять кисточку или мягкую ткань, смоченную водой или спиртом. Раз в год микроскоп должен просматривать мастер-оптик.

9.

Метод используется для окраски спор и кислотоустойчивых бактерий (микобактерии туберкулеза). Кислотоустойчивость связана с наличием в клеточной стенке мяколовых кислот. Метод Циль-Нильсена основан на использовании концентрированных красителей прогревания.

Методика окраски:

1. На фиксированный мазок накладывают белую фильтровальную бумагу и наливают карболовый фуксин Циля. Препарат 2-3 раза подогревают в в пламени до появления паров.	Карболовый фуксин-основная краска; прогревание-протрава.
2. Препарат промывают водой, бумагу сбрасывают.
3. Препарат обесцвечивают в 5% растворе серной кислоты.	Серная кислота-обесцвечивающий фактор.
4. Промывают водой
5. Докрашивают синькой Леффлера 3-5 минут	Синька Леффлера — дополнительная краска
6. Промывают водой, высушивают, смотрят под иммерсией	Кислотоустойчивые бактерии и споры рубиново - красного цвета, а остальная микрофлора — синего цвета

10

Жгутики являются органами движения бактерий, состоят из белка флагеллина. По количеству и характеру расположения жгутиков различают бактерии, монотрихи, лофотрихи, амфитрихи и перитрихи. Жгутики обладают антиген­ными свойствами (Н-антиген) и дают возможность бактериям перемешаться в жидкой среде.

О наличии жгутиков можно судить по характеру движения бактерий в «раздавленной» и «висящей» каплях при опущенном конденсоре и частично прикрытой диафрагме микроскопа.

Метод «раздавленной капли»

Культуру в изотоническом растворе хлорида натрия наносят на предмет­ное стекло и сверху накладывают покровное. Капля материала должна быть та­кой величины, чтобы она заполняла все пространство между покровным и предметным стеклом и не выступала за пределы покровного. Препарат рас­сматривают с иммерсионной системой и слегка опущенным конденсором.

Метод «висячей капли»

Необходимо иметь предметное стекло с лупочкой. Каплю культуры нано­сят на покровное стекло, сверху накладывают предметное стекло с лупочкой посредине, края которого предварительно обмазаны вазелином. Затем предмет­ное стекло слегка прижимают к покровному, и препарат переворачивают по­кровным стеклом кверху. Получается герметично закрытая камера, в которой капля долго не высыхает.

11.

К основным питательным средам, применяемым для культивирования большинства видов бактерий относятся мясо — пептонный бульон и мясо-пептонный агар.

Приготовление мясо — пептонного бульона (МПБ)

Первый этап - получение мясной воды. Мясо, очищенное от жира и от су­хожилий, пропускают через мясорубку, заливают двойным количеством холод­ной водопроводной воды и настаивают в течение суток в прохладном месте. За­тем мясной настой вместе с мясом кипятят в течение 1 часа, после чего осту­жают, фильтруют, доливают водопроводной водой до первоначального объема, разливают по бутылям и стерилизуют при давлении 1атм. 30 минут.

Мясная вода содержит минеральные вещества, углеводы, витамины.

Второй этап - к мясной воде прибавляют 1% сухого пептона и 0,5% хлори­да натрия, кипятят, устанавливают рH 20 % раствором едкого натра.

Приготовление мясо — пептонного агара (МПА)

К мясо — пептоному бульону добавляют 2% морской водоросли агар-агара, который плавится при 100°С и затвердевает при комнатной температуре. После стерилизации в автоклаве мясо — пептонный агар, разлитый в пробирки, остав­ляют застыть столбиком или готовят скошенный агар, укладывая пробирки в наклонном положении под углом 20°С.

12

Посев из пробирки в пробирку

Обе пробирки держат в левой руке слегка наклонно, причем пробирку с посевным материалом держат ближе к себе. В правой руке, как писчее перо держат бактериальную петлю и прокаливают ее вертикально в пламени горел­ки. Мизинцем и краем ладони правой руки вынимают одновременно пробки из обеих пробирок - края пробирок обжигают в пламени горелки. Прокаленной петлей набирают немного посевного материала и вносят в пробирку с жидкой средой. Необходимо следить за тем, чтобы среда не вылилась и не касалась пробки. После посева петлю извлекают из пробирки, края пробирки обжигают и, проведя пробку через пламя горелки, закрывают пробирку, после чего прока­лывают петлю. Посев жидкого материала можно производить стерильными пастеровскими или градуированными пипетками. Пробирки с засеянной куль­турой этикируют и помешают в термостат.

13.

Посев в чашку Петри шпателем

Левой рукой приоткрывают крышку. Материал набирают петлей или в пи­петку, наносят на поверхность МПА и втирают шпателем по всей поверхности агара. При посеве материала, обильно обсемененного микрофлорой, использу­ют 2-3 чашки для последовательного посева.

Посев в пробирку петлей

Полученные изолированные колонии служат для выделения чистой куль­туры микроба.

Осторожно приподняв крышку чашки, захватывают прокаленной и осту­женной петлей одну отдельно расположенную колонию и вносят в пробирку с плотной питательной средой. Пробирку держат в наклонном положении в ле­вой руке между большим и указательным пальцами. Правой рукой держат пет­лю с посевным материалом. Мизинцем, мякотью ладонью правой руки выни­мают пробку из пробирки, обжигают в пламени горелки ее край и вносят в нее петлю, посев производят:

а) штрихами на поверхности агара;

б) уколом в столбик агара.

При посевах и пересевах внимание работающего должно быть обращено на соблюдение правил стерильности: чтобы с одной стороны не загрязнить свои посевы посторонней микрофлорой, а с другой — не явиться источником инфек­ции для окружающих.

14

Сущность условий, необходимых для культивирования анаэробов, заклю­чается в снижении парциального давления молекулярного кислорода.

Механические методы:

1. Посев уколом в столбик сахарного агара.

2. Метод Виньял-Вейона: в расплавленный и остуженный до 50° С агар вносят исследуемую анаэробную культуру, перемешивают и засасывают в пас­теровскую пипетку, конец которой запаивают. Через 24 — 48 часов столбике агара вырастают ясно видимые колонии микробов — анаэробов.

3. Метод Перетца. Исследуемый материал вносят в 3 пробирки с физиоло­гическим раствором, а затем в 3 пробирки с остуженным до 50° С МПА. Со­держимое пробирок перемешивают и выливают в 3 стерильные чашки Петри, на дно которых предварительно кладут стерильное предметное стекло, через 18-20 часов инкубации в термостате под пластинками стекла вырастают ана­эробы.

Физические методы:

1. Анаэростат — создание вакуумных условий.

2. Аппарат Киппа — замена воздуха индифферентным газом (водородом).

3. Среда Китт-Тароцци — содержит кусочки печени, обладающие высокой адсорбционной способностью, 0.5% глюкозы. Перед посевом среду кипя­тят на водяной бане не менее 15 минут, сверху заливают слоем вазелиного мас­ла, чтобы предохранить посев от проникновения кислорода,

Химические методы

1. Прибор Омелянского — для поглощения кислорода используется пиро­галлол.

2. Среда Вильсон — Блера. Содержит глюкозу, сернисто-кислый натрий, хлорид железа. Анаэробы образуют черные колонии за счет восстановления сернисто-кислого натрия в сернистый натрий, который, соединяясь с хлоридом железа, образуют осадок черного цвета - сернистое железо.

Биологический метод Фортнера

Чашку Петри с толстым слоем агара делят на 2 половины на одну полови­ну засевают облигатный аэроб — «чудесную» палочку, на другую половину чашки засевают исследуемую анаэробную культуру. Чашку заливают растоп­ленным парафином. Через 24 — 48 часов в чашке вырастают аэробы, затем, ко­гда запас кислорода исчерпывается, начинают размножаться анаэробы.

15

Чистая культура — это популяция микроорганизмов одного вида. Для выде­ления чистой культуры аэробов используют методы, основанные на:

1. Механическим разобщением бактериальных клеток;

2. Действии физических и химических факторов, оказывающих избира­тельное действие;

3. Способности некоторых бактерий размножаться в организме.

Метод Дригальского основан на механическом разобщение на поверхности плотной питательной среды микробов всех видов, входящих в состав исследуе­мого материала.

I этап.

1. Определение микробного состава исследуемого материала (приготовле­ние мазка, окраска по Граму).

2. Посев в чашку Петри: одну каплю материала наносят на поверхность МПА и растирают шпателем. Не обжигая шпателя и не набирая нового мате­риала, засевают вторую и третью чашки.

3. Засеянные чашки переворачивают вверх дном и инкубируют в термостате 18-20 часов при температуре 37° С.

II этап.

1. Микроскопическое изучение колонки по величине, форме, окраске, ха­рактеру поверхности, краев, консистенции колонии.

2. Микроскопическое изучение одной исследуемой колонии (приготовле­ние мазка, окраска по Граму).

3. Оставшуюся часть колонии пересевают в пробирку со скошенным ога-ром.

4. Пробирку инкубируют в термостате 18-20 часов при температуре 37° С. III этап.

Проверка культуры на чистоту (макроскопическим — однородный рост, микроскопическим - однородные по морфологическим признакам и тинкториальным признакам клетки). Идентификация проводится по:

- ферментативным свойствам.

- антигенным свойствам фагочувствительности токсигенности и другим признакам

16

I этап — обогащение на среде Китт — Тароцци, предварительно прокипячен­ной в течение 30 минут. После посева среду прогревают 15 минут при 80°С для уничтожения вегетативных форм, споры анаэробов при этом сохраняются. II этап — получение изолированных колоний На средах Китт — Тароцци обнаружи­вается помутнение с пузырьками газа. Выделение чистой культуры проводится по одному из следующих методов:

А) по Цейсслеру — каплю материала со среды Китт — Тароцци засевают в чашку с кровяным агаром и распределяют материал шпателем, этим же шпате­лем производят посев во второй и третьей чашках;

Б) по Вейнбергу: каплю материала со среды Китт — Тароцци переносят в растопленный и слегка остуженный сахарный агар, затем набирают в трубки Виньял — Вейона и инкубируют в термостате. Ш этап — выделение чистой куль­туры на среде Китт — Тароцци.

17

Куриный эмбрион используется для культивирования вирусов, микоплазм. Используют эмбрионы в возрасте 8-14 дней в зависимости от вида вируса и способа заражения; на хорион-аллантоисную оболочку, в аллантоисную и ам-ниотическую полость, в желточный мешок. Перед-заражением определяют жизнеспособность эмбриона в овоскопе и отмечают карандашом на скорлупе границы воздушного мешка. Заражение куриных эмбрионов производят в боксе в строго асептических условиях, пользуясь инструментом, стерилизованным кипячением. Скорлупу над воздушным пространством протирают спиртом, об­жигают в пламени, смазывают 2% раствором йода, снова протирают спиртом и обжигают. Вирусный материал в количестве 0.05 — 0.2 мл наносят на хорион-аллантоисную оболочку туберкулиновым шприцом или пастеровской пипеткой.

Вскрытие эмбрионов производят через 48 — 72 часа инкубации в термоста­те. Наличие вируса в хролантоиской оболочке определяют:

1. По белесоватым непрозрачным пятнам разной формы;

2. В реакции гемаглютинации.

18

Метод Грама введен в 1884 году датским микробиологом Гансом Хри­стианом Грамом и является важным таксономическим признаком.

К грамположительным бактериям относятся те, у которых комплекс, образуемый генцийнвиолйтом и йодом, удерживается при обработке их спиртом.

Грамотрицательными называют те бактерии, которые не обладают свойст­вом удерживать комплекс и обесцвечиваются при обработке спиртом.

Способность или неспособность клеток удерживать комплекс генцианвио-лета с Йодом связывают с различным составом и структурой клеточной стенки бактерий.

Методика окраски:

1. На фиксированный мазок накладывают фильтровальную бу­магу, пропитанную генцианвиолетом и наносят каплю воды на 2 ми­нуты

2. Бумагу сбрасывают и, не промывая водой, наливают раствор Люголя на 1 минуту

Препарат обесцвечивают 3-5 каплями спирта в течении 30 се­кунд до прекращения отхождения фиолетовых струек краски

3. Промывают водой

4. Докрашивают водным фуксином Пфейффера в течении 1 -2 минут

5. Промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют под иммерсией