Особенности организации генома растений

Особенности организации генома растений

Термин «геном» впервые был введен немецким ботаником Гансом Винклером в 1920 году для обозначения генетического материала, составляющего гаплоидный набор хромосом у растений.

Информационной макромолекулой генома эукариот (в частности и растений) является ДНК, которая неравномерно распределена по нескольким хромосомам в виде комплексов с многочисленными белками. Однако, генетическую информацию в клетках содержат не только хромосомы ядра. Жизненно важная генетическая информация заключена и во внехромосомных молекулах ДНК – в митохондриях и пластидах. 

Суммарное количество ДНК на гаплоидный геном (величина С) является важной биологической характеристикой организма. Общее содержание ДНК в геноме принято измерять в парах нуклеотидов (п. н.), пикограммах и в дальтонах. Соотношение между этими величинами таково: 1 пкг = 0,965 Ч 109п. н. = 6,1 Ч 1011дальтон.

Геном эукариот существенно отличается от генома прокариот избыточностью, т. е. эукариотическая клетка содержит во много раз больше генов, чем прокариотическая. Повышенное содержание ДНК в геноме эукариот объясняется тем, что большая часть их геномной ДНК представлена не кодирующими последовательностями нуклеотидов. Феномен несоответствия между размерами генома и сложностью организмов, а также избыток ДНК по сравнению с ее количеством, необходимым для кодирования белков получил название «парадокса С».

В отличие от большинства высших эукариот, растения характеризуются значительной изменчивостью размера геномов. Значительная изменчивость размеров генома может быть обусловлена несколькими причинами:

1) полиплоидией;

2) дупликацией/редукцией хромосом или их участков;

3) накоплением/удалением не кодирующей, «избыточной», «ненужной», «эгоистичной» ДНК.

       Определенный вклад в изменчивость генома вносят также процессы дупликации генов с их последующей инактивацией и перенос ДНК из других видов.

Полиплоидия –это кратное увеличение числа наборов хромосом. Автополиплоиды образуются путем кратного увеличения одного и того же генома в результате спонтанного удвоения числа хромосом или формирования нередуцированных гамет. Аллополиплоиды (амфиплоиды) образуются на основе объединения двух или нескольких целых геномов, принадлежащих разным видам и родам (гибридная полиплоидия).

В последние годы с помощью сравнения (in silico) геномов растений, первичная структура которых в той или иной степени определена, удалось выявить многочисленные случаи «скрытой полиплоидии», или палеополиплоидии, у растений. Так, например, было установлено полиплоидное происхождение кукурузы, хотя геном современного вида не является истинно полиплоидным.

Все эти события привели к возрастанию содержания ДНК за счет увеличения числа хромосом. Следует отметить, что наряду с увеличением числа хромосом в процессе эволюции растений также отмечены случаи их редукции за счет теломерных слияний и инактивации одной из центромер. На цитологическом уровне это можно наблюдать с помощью ибридизации in situ: сигналы теломерной последовательности появляются  в  интерстициальных  участках хромосом  –  внутренние  теломерные  районы или ITR(interstitial telomeric repeats).

Многочисленные случаи полиплоидии, включая палеоплоидию, с одной стороны, и редукция числа хромосом за счет теломерных слияний с другой, привели к широчайшей изменчивости числа хромосом у растений.

Высокие числа хромосом (> 500) характеризуют мхи и папоротники. Максимальное число хромосом (2n = 1440) зарегистрировано у папоротника Ophioglossum reticulatum, у цветковых растений – у пальмы Voanioala gerardii  (2n = 596) из  субтропических  лесов  Мадагаскара. Предполагают, что виды с числом хромосом n > 10 являются полиплоидами.

Варьирование  размера  генома  у  растений c одинаковым числом хромосом в основном  связано с количественными изменениями повторяющихся последовательностей ДНК.

Повторяющиеся последовательности (ПП) –  это последовательности ДНК, многократно повторенные в геноме.

ПП классифицируют по способу организации в геноме. В соответствии с этим показателем выделяют два основных типа ПП:

1) тандемно организованные последовательности, представленные  многократным  повторением  одной  и той же последовательности ДНК (мономера) и

2)  более  сложно  организованные  группы  последовательностей – диспергированные повторы.

Тандемные  повторяющиеся  последовательности (ПП) впервые были обнаружены во фракции сателлитной ДНК, которая отличается от  остальной  ДНК  по  плавучей  плотности  и может  быть  изолирована  в  виде  отдельного пика  при  центрифугировании  в  градиенте плотности  хлористого  цезия.  В  зависимости от длины повторяющейся единицы (мономера), тандемные ПП относятся к микросателлитной, минисателлитной и сателлитной ДНК. Из кодирующих тандемно организованных  последовательностей  наиболее  детально охарактеризованы гены рибосомальной РНК.

Сателлитная  ДНК состоит  из  тандемно организованных  последовательностей  ДНК с  длиной  повторяющейся  единицы  от  ста  до нескольких  т. п.н.  Для сателлитов характерен ряд свойств:

Быстрая и точная реассорция в процессе ренатурации ДНК; Высокий  уровень  копийности (105 – 106);  Простая первичная структура; Гомогенный состав (протяженные кластеры одних и тех же повторяющихся блоков последовательностей); Пурин-пиримидиновая асимметрия в распределении нуклеотидов по цепям ДНК; Концентрирование в прицентромерном гетерохроматине; Ограниченная репликация (недорепликация) при политенизации хромосом; Нахождение в составе хромосом в виде тандемно (друг за другом) расположенных кластеров.

  Использование сатДНК  в  качестве  зондов  при  гибридизации in situ  показало,  что  они  располагаются  в  гетерохроматических районах хромосом вблизи теломерных  и  центромерных  участков.  Распространение сателлитных ДНК, как правило, ограничено одним или группой близкородственных видов. Они могут составлять до 10–20 (50) % от общего размера генома, и нередко именно с  ними  связаны  значительные  различия  в  содержании  ДНК  у  близкородственных  видов. Показано  также,  что  тандемно  организованные  последовательности  ДНК  участвуют  в формировании  таких  функционально  важных участков хромосом, как теломеры, центромеры и ядрышкообразующие районы.

Отождествление сателлитной ДНК с гетерохроматином означает, что высокоповторяющаяся ДНК не экспрессируется с образованием полипептидов или РНК. Локализация сатДНК в области центромеры говорит о том, что она выполняет некоторую структурную функцию в хромосоме при митозе и мейозе (возможно, участвует в процессе расхождения хромосом).

Микросателлиты  – семейства  коротких (1–6 п. н.) тандемно организованных повторов, образуют кластеры 20-60 н. п. Отдельные классы микросателлитов значительно отличаются по частоте встречаемости и распределению в геноме. У растений в целом преобладает микросателлит (AT)n, а геномы двудольных растений содержат меньше GC-содержащих  повторов, чем геномы однодольных. Кодирующие и некодирующие участки ДНК также отличаются по составу фракций микросателлитов. Кол-во на геном – 104-105 копий, распределены по геному равномерно.

Минисателлиты имеют длину повторяющего мономерного звена от 9 до 100 п. н., часто 15 п. н. Они образуют кластеры  размером  5–30  т. п.н.,  расположенные преимущественно в эухроматических участках геномов. Большинство из них относится к GC-типу, но известны AT-обогащенные варианты. К классу минисателлитов относятся теломерные повторы. Кол-во минисателлитов на геном – от нескольких сотен до нескольких тысяч копий.

Уникальные (неповторяющиеся) последовательности – наиболее сложный компонент генома эукариот. Содержание варьируется от 15 до 98%. Процентное содержание уникальных последовательностей у низших эукариот заметно больше, чем у высших. Особенно мало уникальной ДНК у растений. Большая часть уникальных последовательностей является некодирующей и обычно не заключает в себе генетической информации, т. е. не кодирует функционально значимые полипептидные цепи или РНК. (пример – интроны, последовательности между генами).

Для объяснения основной функциональной роли «избыточной» ДНК в геноме эукариот предложена гипотеза «альтруистической» ДНК. Именно избыточные последовательности ДНК оказывают стабилизирующее влияние на генетическую информацию, заключенную в геноме многоклеточных организмов. Они разбавляют кодирующие последовательности некодирующими таким образом, что последние выступают в роли ловушки мутагенов. Избыточные последовательности, принимая удар мутагенов на себя, специфически защищают жизненно важные участки ДНК от мутаций.

Существенную часть генома эукариот (10-30%) составляют повторяющиеся последовательности, имеющие определенную структурную организацию и способные перемещаться в геноме как в пределах одной хромосомы, так и между хромосомами. Они получили название подвижных (мобильных) генетических элементов (МЭ).

В начале 1940-х годов американская исследовательница Барбара Мак-Клинток открыла существование гена или локуса, который вызывал повышенные частоты хромосомных перестроек у кукурузы. Среди потомков от скрещивания, в котором оба родителя несли такие перестройки, появились нестабильные мутации с неожиданно высокой частотой. В 1948 году результаты исследований этого локуса, вызывающего разрывы хромосом привели к выводу, что он был совершенно необычным, т. к. мог перемещаться из одного участка хромосомы в другой. Мак-Клинток назвала феномен перемещения транспозицией, а сами локусы – «контролирующими элементами» (КЭ). Свойства КЭ:

1. они могут перемещаться из от одного сайта в другой.

2. их встраивание в данный район влияет на активность генов, расположенных рядом.

3. утрата КЭ в данном локусе превращает прежде мутационный локус в стабильный.

4. в сайтах, в которых присутствуют КЭ, могут возникать делеции, транслокации, транспозиции, инверсии, разрывы хромосом.

/Автономные КЭ способны вырезаться и транспозироваться, их внедрение ведет к появлению нестабильных аллелей, неавтономные КЭ – могут активироваться только определенными автономными элементами/.

1983 – Нобелевская премия за открытие МЭ.

В последние годы в связи с масштабными работами по анализу  первичной  структуры  ДНК  наиболее часто  описывают  мобильные  элементы  двух типов: элементы класса 1 (ретротранспозоны) и элементы класса 2 (ДНК-транспозоны). МЭ класса I перемещаются по геному с помощью механизма обратной транскрипции РНК-интермедиатов. Это обеспечивает размножение МЭ класса I путем «копирования–встраивания» и объясняет их широкую представленность в геномах  растений. 

В отличие от ретроэлементов, распространение которых включает стадию транскрипции и происходит с помощью РНК-интермедиатов, ДНК-транспозоны перемещаются с помощью механизма  «вырезания–встраивания»  фрагментов  ДНК  (подкласс  1)  или  посредством репликации  ДНК  (подкласс  2). 

Характерной особенностью ДНК-транспозонов подкласса 1 является наличие концевых инвертированных повторов  (Terminal Inverted Repeats – TIR). Транспозиция  элементов  первого  подкласса происходит с помощью фермента транспозазы.

Значительная  часть МЭ  представлена  в  геноме  неавтономными элементами, у которых либо полностью, либо частично  отсутствуют  кодирующие  последовательности. Неавтономные элементы способны  к  транспозиции  только  за  счет  активации автономными  элементами  соответствующего семейства генома.

Особенности генома пластид растений.

Введение.

Подобно митохондриям, хлоропласты имеют собственную генетическую систему, обеспечивающую синтез ряда белков внутри самих пластид. В матриксе хлоропластов обнаруживаются ДНК, разные РНК и рибосомы. ДНК хлоропластов резко отличается от ДНК ядра. Она представлена циклическими молекулами длиной до 40-60 мкм, 120-290 тыс. п. н.. В одном хлоропласте может быть множество копий ДНК. Так, в индивидуальном хлоропласте кукурузы присутствует 20-40 копий молекул ДНК. Длительность цикла и скорость репликации ядерной и хлоропластной ДНК не совпадают. ДНК хлоропластов не состоит в комплексе с гистонами. Все эти характеристики ДНК хлоропластов близки к характеристикам ДНК прокариотических клеток. Более того, сходство ДНК хлоропластов и бактерий подкрепляется еще и тем, что основные регуляторные последовательности транскрипции (промоторы, терминаторы) у них одинаковы. На ДНК хлоропластов синтезируются все виды РНК (информационная, трансферная, рибосомная).

Размножение пластид.

Пластиды образуются за счет деления существующих пластид, при чем это происходит независимо от деления клетки. Пропластиды способны к интенсивному делению, причем все гены, контролирующие этот процесс, имеют ядерную локализацию. Чаще делятся пропластиды, эпиопластиды и молодые хлоропласты, однако способность к делению сохраняется и у зрелых хлоропласт.

Геном и белоксинтезирующая система пластид.

Все пластиды имеют собственный геном и белоксинтезирующую систему. У большинства видов пластидная ДНК содержит два инвертированных повтора (IRa and IRb), разделяющих ее на две неравные области.

ДНК пластид содержит около 100 генов, причем их набор близок для разных видов. Все идентифицированные гены можно разделить на две группы:

Гены, обслуживающие процессы транскрипции и трансляции белков пластид (гены «домашнего хозяйства») Гены белков, обеспечивающих «полезную работу» пластид, прежде всего процесс фотосинтеза.

Многие пластидные гены организованы в виде оперонов – блоков генов, считывающихся с одного промотора. Ряд пластидных генов состоит из чередующихся экзонов и интронов.

Белки, кодируемые в пластидном геноме.

Функциональные белки фотосинтетического аппарата чаще кодируются в геноме хлоропластов, тогда как регуляторные или «дополнительные» – в ядерном геноме.

РНК-полимеразы пластид.

Транскрипция пластидных генов обеспечивается двумя типами РНК-полимераз, одна из которых кодируется в ядре клетки, другая – пластидной ДНК.

Собственная РНК-полимераза обладает прокариотическими чертами. Состоит из 4х типов субъединиц б2 в в’в'' (характерна для пропластид и этиопластов). Эти субъединицы кодируются в пластидном геноме. Такая РНК-полимераза не может узнавать промоторные области генов, для этого к ней должна присоединиться д-субъединица, которая кодируется ядерным геномом. Ядерная локализация этих генов, вероятно, является результатом перемещения генетического материала пластид в ядро.

В темноте РНК-полимераза пластид неактивна, поэтому работает другая РНК-полимераза кодируемая ядерным геномом.

Все гены можно разделить на три группы:

Имеющие стандартные эубактериальные промоторы – к ним относятся почти все гены белков, участвующих в фотосинтезе, их транскрипцию обеспечивает собственная РНК-полимераза пластид. Имеющие нестандартные промоторы – такие промоторы свойственны лишь немногим генам; важно, что таким промотором снабжен rif-оперон, содержащий гены пластидной РНК-полимеразы; их активность связана с мономерной РНК-полимеразой фагового типа; Имеющие универсальные промоторы – подобные промоторы характерны для большинства генов «домашнего хозяйства» пластид; успешно распознаются обеими РНК-полимеразами.

Особенности генома митохондрий растений.

Геном митохондрий высших растений.

Высшие растения имеют наиболее крупный митохондриальный геном среди эукариотических организмов – это сотни тысяч п. н. У большинства высших растений мтДНК представлена многочисленными кольцевыми молекулами размером не более 80 тыс. п. н. Крупная митохондриальная ДНК часто содержит значительное количество протяженных повторов, а потому способна к внутри и межмолекулярной рекомбинации с образованием большого числа кольцевых молекул различного размера. В митохондриальном геноме растений, помимо крупных кольцевых молекул ДНК, часто присутствует кольцевые и линейные плазмиды.

У высших растений мтДНК содержит чуть больше 50 генов. Подавляющая часть генома состоит из некодирующих последовательностей. Гены отделены друг от друга по меньшей мере несколькими тысячами нуклеотидных пар, поэтому каждый ген обычно считывается автономно.

Особенности изучения геномов растений

Предполагается, что расшифровка геномов растений откроет перед наукой и практикой широкие перспективы. Прежде всего выявление новых генов и цепочки их генетической регуляции позволит существенно повысить продуктивность растений за счет использования биотехнологических подходов. С обнаружением, выделением, размножением (клонированием) и секвенированием генов, отвечающих за такие важнейшие функции растительного организма, как размножение и продуктивность, процессы изменчивости, устойчивости к воздействию неблагоприятных факторов среды, а также гомологичное спаривание хромосом, связывают появление новых возможностей для усовершенствования селекционного процесса. Наконец, выделенные и клонированные гены можно использовать для получения трансгенных растений с принципиально новыми свойствами и анализа механизмов регуляции активности генов.

Важность изучения геномов растений подчеркивает и то обстоятельство, что до настоящего времени число локализованных, клонированных и секвенированных генов растений невелико и колеблется, по различным оценкам, между 800 и 1200. Это в 10-15 раз меньше, чем, например, у человека.

Трудности в изучении геномов растений:

Изучение геномов растений - задача значительно более сложная, чем исследование генома человека и других животных. Это связано со следующими обстоятельствами:

• огромными размерами геномов, достигающими для отдельных видов растений десятков и даже сотен миллиардов пар нуклеотидов (п. н.): геномы основных хозяйственно важных растений (кроме риса, льна и хлопка) по размерам либо близки к геному человека, либо превышают его во много раз (таблица – в презенацию);

• резкими колебаниями числа хромосом у различных растений - от двух у некоторых видов до нескольких сотен у других, причем не удается выявить строгой корреляции между размером генома и числом хромосом;

• изобилием полиплоидных (содержащих более двух геномов на клетку) форм с близкими, но не идентичными геномами (аллополиплоидия);

• чрезвычайной обогащенностью геномов растений (до 99%) "незначащей" (некодирующей, то есть не содержащей генов) ДНК, что резко затрудняет стыковку (расположение в правильном порядке) отсеквенированных фрагментов в общий крупноразмерный участок ДНК (контиг);

• неполным (по сравнению с геномами дрозофилы, человека и мыши) морфологическим, генетическим и физическим картированием хромосом;

• практической невозможностью выделять в чистом виде индивидуальные хромосомы с помощью методов, обычно применяемых с этой целью для хромосом человека и животных (сортировка в потоке и использование гибридов клеток);

• трудностью хромосомного картирования (определение расположения на хромосоме) отдельных генов с помощью гибридизации in situ, обусловленной как высоким содержанием в геномах растений "незначащей" ДНК, так и особенностями структурной организации хромосом растений;

• эволюционной отдаленностью растений от животных, что серьезно осложняет использование для изучения геномов растений сведений, полученных при секвенировании генома человека и других животных;

• длительным процессом размножения большинства растений, что существенно замедляет их генетический анализ.

Первичная структура ДНК:

Из множества растительных организмов для исследования были выбраны два - арабидопсис, представляющий класс двудольных (размер генома 125 млн. п. н.), и рис из класса однодольных (420-470 млн. п. н.). Эти геномы невелики по сравнению с геномами других растений и содержат сравнительно немного повторяющихся участков ДНК. Такие особенности давали надежду на то, что выбранные геномы окажутся доступными для относительно быстрого определения их первичной структуры.

Основанием для выбора арабидопсиса послужили не только небольшие размеры его генома, но и мелкие размеры организма, что позволяет легко выращивать его в лабораторных условиях. Принимали во внимание его короткий репродуктивный цикл, благодаря чему можно быстро проводить опыты по скрещиванию и отбору, детально изученную генетику, легкость осуществления манипуляций со сменой условий произрастания (изменение солевого состава почвы, добавление разных питательных веществ и т. д.) и с испытанием действия на растения различных мутагенных факторов и патогенов (вирусы, бактерии, грибы). Арабидопсис не имеет хозяйственной ценности, поэтому его геном, наряду с геномом мыши, получил название справочного.

Что касается функции генов растений, то мы знаем о них менее одной десятой того, что нам известно о генах человека. Даже у арабидопсиса, геном которого по степени изученности намного превосходит геном человека, функция почти половины его генов остается неизвестной (рис.). Между тем у растений, кроме генов, общих с животными, имеется значительное число генов, специфичных только (или, по крайней мере, преимущественно) для них. Речь идет о генах, вовлеченных в транспорт воды и синтез клеточной стенки, отсутствующей у животных, о генах, обеспечивающих образование и функционирование хлоропластов, фотосинтез, фиксацию азота и синтез многочисленных ароматических продуктов. Этот перечень можно продолжить, но уже сейчас ясно, сколь сложная задача стоит перед функциональной геномикой растений.

Полное секвенирование генома дает близкие к истинным сведения об общем количестве генов данного организма, позволяет поместить в банки данных более или менее подробные и достоверные сведения об их структуре, облегчает работу по выделению и изучению индивидуальных генов. Однако секвенирование генома отнюдь не означает установления функции всех генов.