УДК 613.62:616.61:57.044
ВОДНО-СОЛЕВОЙ БАЛАНС И ПАРЦИАЛЬНЫЕ ФУНКЦИИ ПОЧЕК
В ДИНАМИКЕ ХРОНИЧЕСКОЙ ФТОРИСТОЙ ИНТОКСИКАЦИИ
(ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ)
, ,
Научно-исследовательский институт комплексных проблем гигиены
и профессиональных заболеваний, Новокузнецк
Резюме. Изменения водно-солевого баланса и парциальных функций почек ассоциированы с динамикой развития хронической фтористой интоксикации организма. На ранних стадиях (1-3 недели) полиурия, напряженность фильтрационно-реабсорбционных процессов, компенсаторные взаимоотношения фтора и Ca2+ обеспечивают гидро-ионный гомеостаз, сохраняющийся на относительно стабильном уровне до 6-й недели, после которой поступательно нарушаются почечные функции и развивается хроническая форма фтористой интоксикации – флюороз.
Ключевые слова: хроническая фтористая интоксикация, водно-солевой обмен, почки, гомеостаз.
WATER-SALT BALANCE AND PARTIAL RENAL FUNCTION
IN THE DYNAMICS OF CHRONIC FLUORIDE INTOXICATION
(EXPERIMENTAL RESEARCHES)
Yadykina T. K., Mikhailova N. N., Gorokhova L. G., Bugaeva M. S., Kazitskaya A. S.
Research Institute for Complex Problems of Hygiene and Occupational Diseases, Novokuznetsk
Summary. The changes of water-salt balance and partial renal functions are associated with the dynamics of the development of chronic fluoride intoxication. In the early stages (1-3 weeks) polyuria, tension of filtration-reabsorbtion processes, the compensatory relationship of fluorine and Ca2+ provide hydro-ion homeostasis remaining at a relatively stable level up to the 6th week after which progressively renal functions are disturbed and the chronic form of fluoride intoxication – fluorosis – develops.
Key words: chronic fluoride intoxication, water-salt metabolism, kidney, homeostasis.
Исследование механизмов поддержания гомеостаза и регуляции систем жизнеобеспечения в условиях хронического воздействия на организм вредных производственных факторов является актуальным направлением современной медицины труда и профпатологии [4, 5]. Биологической основой модифицирующего действия химических соединений является системное изменение гомеостаза организма [1]. При этом компенсаторно-приспособительные реакции, обеспечивающие гомеостаз, представляют собой разнообразные комбинации функций организма, развертывающиеся на той же, что и в норме, материальной основе, но протекающие с большей интенсивностью и сопровождающиеся своеобразными тканевыми изменениями [3, 12]. Выявить механизмы поддержания гомеостаза в условиях трансформации физиологического ответа организма в патологический позволяют модели, например такие, как экспериментальный флюороз, который развивается при длительном поступлении в организм животных NaF.
С молекулярной точки зрения неорганические соединения фтора полиэффектны и их накопление в организме приводит к постепенным сдвигам жестких показателей гомеостаза на системном уровне [2, 7, 11, 13].
Поддержание относительного постоянства внутренней среды организма обеспечивается прежде всего почками – основным эффекторным органом водно-солевого равновесия [6, 8, 9].
Профессионально обусловленная фтористая нефропатия – хроническое заболевание почек, в генезе которого важную роль играет развитие гломеруло-тубулярной дисфункции и, как следствие, изменение направленности метаболических процессов. Изучению ранних ренальных проявлений при фтористой интоксикации посвящено незначительное количество работ и практически единичны попытки выявить стадии развития данной патологии и критерии их определения. В связи с вышесказанным, целью исследования явилось изучение особенностей изменения водно-солевого баланса и парциальных функций почек организма в динамике развития экспериментального флюороза.
Материал и методы исследования. Для решения поставленных задач были проведены эксперименты на белых нелинейных крысах-самцах массой 200-250 г. Общее число животных – 130. Крыс содержали в стандартных условиях вивария. Эксперименты проводили в соответствии с международными правилами Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных целей «Guide for the Care and Use of Laboratory Animals».
Поступательный сдвиг гомеостаза вызывали в опытной группе свободным доступом крыс к раствору NaF в концентрации 10 мг/л (суточная доза 1,2 мг/кг массы тела), соответствующей ПДК по ГОСТу 2784-54. Такое количество NaF не является токсичным, однако в связи со способностью фтора накапливаться в организме, при длительном его поступлении (продолжительность эксперимента составила 12 недель) развивается флюороз. Для каждой серии набиралась группа сравнения (контрольные животные). Для изучения метаболических изменений исследовали биохимические показатели крови, забор которой осуществляли из хвостовой вены на 2-е, 4-е сутки и через 1, 3, 6, 9, 12 недель эксперимента. Суточный диурез определяли в эти же сроки метрическим способом (мочу собирали в обменных клетках для крыс). Концентрацию фтора (F) в моче определяли ионоселективным методом на иономере «Анион-4100» с использованием фтор-селективного электрода. Парциальные функции почек рассчитывали по общепринятым формулам. Для характеристики метаболических изменений в плазме крови и моче стандартными методами с использованием реактивов -Бест» (Новосибирск) определяли: содержание общего белка и альбумина, глюкозы, ионограмму (Na+, K+), концентрацию Ca2+, Рн., мочевины, креатинина. В плазме крови определяли уровень паратиреоидного гормона (ПТГ) и кальцитонина (наборы «Diagnostic System Laboratories» и «Nordic Bioscience»). В отдельной серии экспериментов после декапитации, которую проводили под эфирным наркозом, забирали фрагменты почек для гистологического исследования. Статистический анализ полученных результатов проводили на основе вычисления средних значений показателей (М) и их ошибок (±m). Различия показателей оценивали по t-критерию Стьюдента и считали достоверными при р≤0,05; 0,01; 0,001. Сравнение групп данных проводили на основе линейного корреляционного анализа с использованием коэффициента корреляции (r).
Результаты. Длительное воздействие NaF оказывает влияние на характер всей совокупности метаболических процессов. Ответная реакция организма на фтористое воздействие сопровождается включением адаптивных механизмов, обеспечивающих в начальный период (1 неделя) поддержание физиологического уровня общего белка, альбумина и глюкозы в плазме крови. К 3-й неделе снижение этих показателей было обусловлено усилением глюкозо-аланинового шунта и использованием альбуминов в детоксикационной цепи. Понижение уровня белков коррелировало с полуторакратным повышением содержания мочевины – важнейшего продукта белкового распада (r=0,6*; р=0,04). Шестая неделя сопровождалась снижением содержания мочевины в плазме крови крыс опытной группы на фоне гипоальбуминемии. К 9-й неделе фтористой агрессии, на фоне сохранения уровня общего белка, содержание альбуминов в сыворотке крови в 1,5 раза превысило контрольные значения, что, возможно, связано с усилением их синтеза в связи с возросшими потребностями организма в транспортных белках. Содержание глюкозы в плазме крови сохранялось на физиологическом уровне до 6-й недели. На стадии крайней напряженности синтетических процессов (9-12 недель) её содержание достоверно снизилось, что согласуется с литературными данными о развитии гипогликемии в условиях хронической фтористой интоксикации (ХФИ) [10].
Для выяснения роли почек в поддержании гомеостаза организма были проанализированы основные парциальные функции: средний диурез, фильтрационно-реабсорбционные процессы, ионоурез. Полиурия поступательно нарастала с 4-х суток эксперимента (выявлено двукратное увеличение суточного диуреза) и достигла максимума к 9-й неделе (табл. 1). Полиурия, вызванная введением избытка фтора, обусловлена нарушениями концентрирующего механизма и является результатом увеличения притока крови к мозговому веществу почек, повышенной проницаемости сосудов, уменьшения реабсорбции Na+ в восходящей ветви петли Генле. В то же время усиление диуреза имеет приспособительный характер, обеспечивающий выведение из организма повышенных доз фтора (F). К 12-й неделе средний диурез снизился в 1,7 раза по сравнению с контролем и почти в 3 раза по сравнению с показателем 9-й недели, свидетельствуя о развитии резкой анурии, обусловленной уменьшением коркового слоя, неизбирательным всасыванием клубочкового фильтрата через стенку поврежденного почечного канальца и развитием токсического нефросклероза почек.
Таблица 1
Показатели парциальных функций почек и водно-солевого обмена в динамике
фтористой интоксикации у крыс (М±m)
Показатель | Срок эксперимента | ||||
1 неделя | 3 недели | 6 недель | 9 недель | 12 недель | |
Средний | 4,6±0,86*** 3,3±0,01 | 4,0±0,12* 2,9±0,31 | 4,2±0,29* 2,9±0,42 | 4,3±0,26** 2,5±0,22 | 1,61±0,41**### 2,8±0,20 |
СКФ (F), | 394,5±17,04* 459,9±26,90 | 391,3±46,60 495,2±42,67 | 349,6±10,05* 472,0±50,05 | 312,1±37,0* 442,4±30,8 | 428,4±50,96 458,8±55,29 |
Экскретируемая фракция жидкости, (EFH2O), % | 0,91±0,07 0,69±0,08 | 1,02±0,09* 0,59±0,08 | 0,93±0,08* 0,62±0,04 | 0,85±0,08* 0,57±0,05 | 0,39±0,05*** 0,61±0,04 |
Экскреция натрия (UNa·V), | 365,2±10,2*** 253,9±12,8 | 417,3±25,8*** 231,1±21,4 | 702,7±22,8*** 264,9±18,5 | 801,8±29,4** 243,0±15,7 | 305,2±22,4***^^ 267,1±18,9 |
Экскреция калия (Uk·V), | 73,7±19,5 90,3±5,7 | 90,0±26,6 93,4±11,6 | 83,0 ±7,7 94,0±15,9 | 180,2±40,6** 91,8±8,8 | 122,7±10,0* 93,2±22,36 |
Экскретируемая фракция натрия (EFNa), % | 0,43±0,07 0,35±0,09 | 0,45±0,12* 0,29±0,08 | 1,21±0,11*** 0,32±0,07 | 1,19±0,09*** 0,32±0,06 | 0,44±0,09^ 0,34±0,42 |
Экскретируемая фракция калия (EFк), % | 2,49±1,10 2,29±0,53 | 2,58±0,34 3,12±0,38 | 3,26±0,66 3,12±0,65 | 3,16±0,82 3,42±0,50 | 2,91±0,50 3,29±0,33 |
Примечания: * – при р<0,05; ** – при р<0,01; *** – при р<0,001 – достоверные различия данных по сравнению с контрольной группой животных; ^ – при р<0,05; ^^ – при р<0,01 –достоверные различия данных по сравнению с 9-й неделей; ### – при р<0,001 – достоверные различия данных по сравнению с 1-й неделей.
Анализ фильтрационно-реабсорбционных процессов показал, что полиурия развивалась на фоне поступательного снижения скорости клубочковой фильтрации (СКФ), обусловленного изменением отмеченного нами морфологического состояния гломерул нефрона: выявлена гипертрофия (набухшие базальные мембраны), атрофия и гиперемия гломерул нефрона, малокровие в капиллярах клубочковых петель. Получена отрицательная корреляционная связь между уровнем среднего диуреза и СКФ (r=-0,7; р=0,04*). Логичным следствием нарушения гломерулярной фильтрации являлась выраженная, двукратная креатининурия (до 10,1±1,03** ммоль/л), протеинурия (до 12 мг/л) на фоне нарастающей креатининемии плазмы крови к 12-й неделе. Найдена корреляция между снижением СКФ и увеличением экскреции креатинина (r=-0,8**; р=0,01), белка (r=-0,9***; р=0,0002). Наиболее уязвим к токсическим повреждениям эпителий канальцевого аппарата, что обусловлено повышенной осмотической нагрузкой на нефроны, связанной с выделением высококонцентрированной мочи: экскреция мочевины поступательно нарастала и к концу эксперимента в 1,5 раза превысила фон, составив 211,9±8,39** ммоль/100 г·сут.
На протяжении 9 недель на фоне сниженной фильтрационной загрузки нефрона отмечалось достоверное снижение уровня канальцевой реабсорбции, что выражалось поступательным повышением процента экскретируемой фракции жидкости (EFН2О,%) в 2 раза (табл. 1). Известно, что реабсорбция в почечной медулле обеспечивается анаэробным метаболизмом, который, вероятно, тормозится фтором (F). Возникающая под влиянием NaF полиурия в этот период обусловлена нарушением функции дистального отдела канальцев, так как процессы реабсорбции воды резко угнетаются. К 12-й неделе процент EFН2О снизился в 1,5 раза, свидетельствуя о повышенной реабсорбции на фоне сниженной фильтрации, – как результат рассогласования фильтрационно-реабсорбционных процессов на поздних стадиях ХФИ.
Развитие полиурической реакции является адаптивным механизмом, обеспечивающим максимально эффективную экскрецию F из организма на фоне сохранения концентрации Рн. и Ca2+ в моче и плазме крыс в физиологических пределах. Элиминация абсорбированного F происходит почти исключительно через почки (60-90% фторидов экскретируется с мочой путем клубочковой фильтрации). На 1-й неделе уровень F в моче крыс опытной группы составил 4,85±1,45* ммоль/л (0,68±0,14 ммоль/л в контроле), к 3-й неделе экскреция F увеличилась в 8 раз (рис. 1).
|
Рис. 1. Изменение содержания фтора (F), кальция (Ca2+) и фосфора неорганического (Рн.) в моче крыс в динамике хронической фтористой интоксикации Обозначения: * – при р<0,05; ** – при р<0,01; *** – при р<0,001 – достоверные различия данных по сравнению с контрольной группой животных. |
Уровень F в моче является маркером экспозиции фторидами и рассматривается как один из основных показателей интенсивности их накопления в организме. Так, экскреция F на 6-й неделе превысила фоновые значения более чем в 10 раз, поступательно увеличиваясь к 12-й неделе до 17,5±1,4*** ммоль/л, что почти в 20 раз превысило соответствующий показатель в контрольной группе крыс. Через неделю после поступления в организм NaF концентрация Рн. в моче сохранялась на уровне контроля и составила 32,4±1,8 ммоль/л, а уровень Ca2+ – 1,23±0,1 ммоль/л. На 3-й – уровень Ca2+ в моче увеличился в 1,5 раза, а к 6-й – в 2,5 раза. Усиление выведения Ca2+ с мочой свидетельствует о вымывании его из организма, прежде всего из костной ткани. Содержание Рн. в моче к 3-й неделе составило 31,3±1,6 ммоль/л и сохранялось таковым до 6-й недели, когда содержание его в моче резко возросло. Очевидно, высокий уровень Рн. обусловлен преобладанием реакций анаэробного гликолиза. В результате нарушения синтеза АТФ Рн. не используется в качестве субстрата в макроэргических соединениях. Дефицит АТФ находит свое отражение в нарушении морфофункционального гомеостаза почек. К 9-й неделе наблюдался пик уровня Рн. в моче (81,5±3,4 ммоль/л) и нарушались компенсаторные взаимоотношения между Рн. и Ca2+, о чем свидетельствовал достоверный выброс обоих элементов. Это связано с тем, что отрицательно заряженный ион F атакует положительные ионы Ca2+, образуя слаборастворимую соль (СаF2), которая выводится из организма. Обнаружена положительная корреляционная связь между средним диурезом, содержанием Ca2+ (r=0,6*; р=0,04) и F (r=0,9**; р=0,007) в моче. Причем на 12-й неделе достоверно высокий уровень F, Ca2+ и Рн. в моче наблюдался при снижении среднего диуреза в 1,5 раза. Содержание Ca2+, Рн. в плазме крови на 1-3-й неделях поддерживалось в физиологических пределах и составило для Ca2+ 2,2±0,14 ммоль/л; для Рн. – 2,2±0,08 ммоль/л. Изменение гомеостатической функции почек сопровождалось увеличением содержания Рн. в плазме крови крыс в 1,5 раза на 6-й неделе ХФИ. С 9-й недели уровень Ca2+ в плазме достоверно возрос и составил 2,6±0,12* ммоль/л на фоне сохранения Рн. Компенсаторные взаимоотношения F и Ca2+, очевидные на ранних стадиях, нарушались с 9-й недели ХФИ.
Центральная роль в поддержании гомеостаза Ca2+ и регуляции Рн.-Ca2+ обмена принадлежит ПТГ и кальцитонину. Поскольку высокий уровень ПТГ оказывает фосфатурическое действие, избыток фосфатов экскретировался с мочой, но реабсорбция Ca2+ в почечных канальцах повышалась, часть мобилизованного Ca2+ задерживалась, и уровень его в плазме сохранялся в физиологических пределах до 3-й недели с последующим достоверным повышением с 9-й недели. На этом фоне отмечалась тенденция к снижению уровня кальцитонина, обладающего гипокальциемическим и гипофосфатемическим действием (до 3-й недели), с последующим достоверным снижением, сохраняющимся до конца эксперимента (рис. 2).
|
|
Рис. 2. Изменение содержания паратиреоидного гормона (ПТГ) и кальцитонина
в сыворотке крови крыс в динамике хронической фтористой интоксикации
Обозначения: * – при р<0,05; ** – при р<0,01 – достоверные различия данных по сравнению с контрольной группой животных.
Показатели гидро-ионного баланса обладают большим постоянством и в физиологических условиях могут отклоняться лишь в незначительных пределах, что говорит об исключительном значении почек в регуляции гомеостаза. Поддержание гомеостатических параметров обеспечивалось изменением ионоуретической функции и сопровождалось поддержанием физиологического уровня Na+, К+ в плазме крови до 6-й недели (табл. 2).
Таблица 2
Изменение концентрации натрия и калия в плазме крови крыс в динамике фтористой интоксикации (М±m)
Показатель | Срок эксперимента | ||||
1 неделя | 3 недели | 6 недель | 9 недель | 12 недель | |
РNa+, ммоль/л | 147,5±2,90* 159,0±2,55 | 164,2±7,36 161,5±13,99 | 177,0±6,04** 165,4±9,53 | 215,8±7,17** 172,0±6,38 | 169,0±9,76 170,0±15,09 |
РК+, ммоль/л | 6,5±0,23 7,0±0,49 | 6,6±0,39 7,0±0,26 | 7,9±0,29* 6,9±0,21 | 8,4±0,50** 6,1±0,25 | 6,7±0,22 7,0±0,59 |
Примечания: * – при р<0,05; ** – при р<0,01 – достоверные различия данных по сравнению с контрольной группой животных.
С 9-й недели фтористого воздействия наблюдалось нарушение Na+–К+ равновесия: п очти полуторакратная гипернатриемия и гиперкалиемия плазмы. Первопричиной увеличения К+ в крови является нарушение почечной секреции. На фоне полиурии отмечался калийурез: экскреция калия (Uk·V, ммоль/100 г·сут.) возросла в 1,3 раза, а его экскретируемая фракция (%, EFк) не отличалась от контрольных значений и достоверный натрийурез за счет увеличения экскретируемой фракции натрия (%, EFNa) в 3,8 раза, т. е. снижения канальцевой реабсорбции катиона, что привело к выбросу его с мочой. Ионы Na+ преобладают во внеклеточной жидкости, определяя осмотическую концентрацию плазмы крови, регулируя водно-солевой гомеостаз. Избыточная потеря Na+ и воды может приводить к снижению объёма циркулирующей крови (ОЦК) и внеклеточной жидкости. В организме развиваются компенсаторные реакции, направленные на предотвращение потери Na+: усиливается образование в юкстагломерулярном аппарате (ЮГА) ренина, возникает сужение приводящей артериолы клубочка, снижается СКФ [6]. К 12-й неделе экскреция Na+ и его экскретируемая фракция (%, EFNa) резко снизились по сравнению с соответствующим показателем 9-й недели эксперимента (табл. 1).
Морфоструктура почек до 3-й недели характеризовалась адаптивными признаками в виде полнокровия и утолщения стенок сосудов, расширения просвета капсулы Шумлянского-Боумена. Выявленная пролиферация мезангиальных клеток, диффузная лимфоцитарная инфильтрация, ядерный дуализм, зернистая дистрофия выступают морфологическим выражением гиперфункции. Если в начальный период фтористого воздействия гомеостатическая функция почек поддерживает относительное равновесие физиологических параметров, то на поздних стадиях ХФИ необратимые нарушения фильтрационно-реабсорбционных процессов в нефроне не позволяют сохранить в организме водно-солевой баланс, нарушая жесткие показатели гомеостаза и общую метаболическую картину. Так, с 6-й недели на фоне единичных признаков активного регенераторного процесса: наличия уплощенного нефроэпителия, увеличения числа низких кубических клеток – отмечались нарастающие дистрофические изменения эпителия канальцев с глыбчатым распадом белка необратимого характера, связанные, в частности, с длительным выделением высококонцентрированной мочи (рис. 3, 4).
Рис 3. Морфологические изменения ткани почек крыс на ранних сроках
фтористого воздействия
Примечания: 1 – контроль; 2, 3 – опыт (1 неделя); 4 – опыт (3 недели). Окраска гематоксилин-эозином; Ч 40. Световая микроскопия. Nicon Eclipse E 200.
Рис. 4. Влияние хронической фтористой интоксикации на морфологические изменения ткани почек крыс
Примечания: 5, 6 – опыт (6 недель); 7 – опыт (9 недель); 8 – опыт (12 недель). Окраска гематоксилин-эозином; Ч 40. Световая микроскопия. Nicon Eclipse E 200.
Таким образом, анализ полученных результатов позволяет заключить, что изменения водно-солевого баланса и почечных функций ассоциированы с динамикой развития ХФИ: на стадии физиологического ответа (с 1-й до 6-й недели) сохраняется: морфоструктура почек за счёт активации регенеративных процессов; гидро-ионное равновесие – за счёт полиурии и компенсаторных взаимоотношений F, Рн. и Ca2+. Долговременная адаптация отличается сформировавшейся способностью организма относительно нормально функционировать в новых условиях [1]. Переходный период (с 6-й до 9-й недели) трансформирует стадию физиологического ответа и характеризуется поддержанием основных параметров гомеостаза посредством усиления белкового метаболизма и напряженности фильтрационно-реабсорбционных процессов на фоне нарастающей полиурии.
Патологические почечные процессы начинают регистрироваться с 9-й недели. Относительное постоянство параметров внутренней среды в этот период, вероятно, поддерживается гиперфункцией малого количества интактных нефронов, достаточных для поддержания гомеостаза. Хроническая форма фтористой интоксикации (с 12-й недели) сопровождается формированием токсической нефропатии и выражается олигурией, связанной, в частности, с нарастающей осмотической нагрузкой в этот период, резким снижением суточного диуреза за счёт рассогласования фильтрационно-реабсорбционных процессов и нарушения ионоуретической функции почек. В основе указанных функциональных сдвигов лежат стойкие цитолитические, дистрофические, некротические изменения эпителия канальцевого аппарата нефрона.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
, , Проблемы адаптации и учение о здоровье. М.: РУДН, 2006. Влияние неорганического фтора на живые организмы различного филогенетического уровня // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. 2011. Т. 47, № 5. С. 337-347. , , Динамика компенсаторных механизмов на ранних стадиях интоксикации фтором // Технологии живых систем. 2011. Т. 8, № 1. С. 10-17. , , Новая медицинская технология профессионального риска для здоровья работников промышленных предприятий // Современные наукоемкие технологии. 2013. № 9. С. 136-139. Актуализация вопросов профессиональной заболеваемости // Здравоохранение Российской Федерации. 2013. № 2. С. 14-17. Физиологические механизмы регуляции водно-солевого баланса у животных и человека // Соросовский образовательный журнал. 1996. № 10. С. 4-12. , , Хроническая фтористая интоксикация как фактор риска развития атеросклероза // Гигиена и санитария. 2015. Т. 94, № 5. С. 91-94. Физиология человека: почка // Физиология человека. 2010. Т. 3, № 5. С. 9-18. , , Влияние хронической фтористой интоксикации на парциальные функции почек и водно-солевой обмен // Бюллетень Восточно-Сибирского научного центра Сибирского отделения Российской академии медицинских наук. 2009. № 1. С. 253-254. , , Фтор и его соединения. Серия «Токсикология для врачей». СПб.: Фолиант», 2012. , , Токсическое действие фторида натрия при экспериментальном флюорозе // Бюллетень Восточно-Сибирского научного центра Сибирского отделения Российской академии медицинских наук. 2009. № 1. С. 275-277. Теория переходного состояния между нормой и патологией // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. 2012. № 1. С. 3-12. Гепаторенальные механизмы поддержания гомеостаза в условиях воздействия на организм фторида натрия (экспериментальные исследования) / автореферат дис. ... канд. биол. наук. Томск, 2013.