ACTA NATURAE КРАТКОЕ СООБЩЕНИЕ
УДК 575.1
ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ САЙТОВ ИНИЦИАЦИИ РЕПЛИКАЦИИ ДНК, РАСПОЛОЖЕННЫХ В ХРОМОСОМНОЙ ПОЛОСЕ 9P22 ЧЕЛОВЕКА
*,
Институт молекулярной генетики РАН, 123182, Москва, пл. акад. , 2
*E-mail: *****@***ru
РЕФЕРАТ
Вопрос о тканеспецифической активности мест начала репликации ДНК (oris), регулируемой в ходе онтогенеза, остается малоизученным. В то же время такое знание может служить важным ориентиром как для установления эпигенетической программы развития организма, так и для понимания особенностей этой программы в ходе развития. В настоящей работе предпринята попытка расширить наши знания по этому вопросу на примере сайтов oris, расположенных в АТ-богатой изохоре хромосомной полосы 9p22 человека. С помощью метода количественной полимеразной цепной реакции была измерена активность двух oris в линиях клеток человека, происходящих из эпителия шейки матки (HeLa) и из раннего предшественника нейрональной клетки (HEK293), и сравнена с их активностью в линии иммортализованных фибробластов (CH). Полученные данные показывают, что в ходе дифференцировки клеток может изменяться существенно не только активность сайтов oris, но и могут появляться новые сайты инициации, расширяющие участок инициации. Все это свидетельствует о значительной эпигенетической пластичности по крайней мере некоторых тканеспецифических oris у человека.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА инициация репликации, количественная полимеразная цепная реакция, локус IFNA2 человека, репликационный домен, тканеспецифичные начала репликации, эпигенетическая регуляция.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ oris ─ начала репликации в ДНК; К-ПЦР ─ количественная полимеразная цепная реакция; РД ─ репликационный домен.
ВВЕДЕНИЕ
Геном млекопитающих состоит из регулируемых и нерегулируемых (конститутивных) в ходе онтогенеза сегментов [1]. Основания для концепции регулируемого/нерегулируемого хроматина появились в связи с выявленной тенденцией активных генов реплицироваться на ранней стадии фазы S клеточного цикла, а неактивных ─ на поздней стадии фазы S. Это наблюдение, сделанное вначале для линий культивируемых клеток и на небольшом числе генов [2], было затем статистически обосновано при полногеномных исследованиях с использованием как различных линий клеток [3], так и моделей эмбриогенеза [4].
Современные методы детального анализа репликации клеточного генома («профилирования») на разных стадиях фазы S позволили вычленить регулируемые единицы репликации (участки генома млекопитающих длиной около 1 мегабазы), получившие название репликационных доменов (РД) [1]. Как единое целое они реплицируются в клетках различного типа и как единое целое могут претерпевать согласованные изменения (реорганизацию) в ходе дифференцировки и развития. Те из них, которые устанавливаются после начала транскрипции в ходе эмбриогенеза и в дальнейшем не изменяют время репликации, рассматриваются как конститутивные РД, а те, которые изменяют, ─ как регулируемые РД [1, 4]. Первые расположены в GC-богатых изохорах генома, содержащих незначительное количество элементов LINE (long interspersed nuclear elements), тогда как вторые ассоциированы с тканеспецифическими генами, и половина из них расположена в АТ-богатых и LINE-обогащенных изохорах [2]. РД и соответствующие им хромосомные петли в интерфазе [1, 5] рассматриваются как регулируемые/нерегулируемые единицы генома, запрограммированное взаимодействие между которыми обеспечивает развитие организма и специфические особенности того или иного типа клеток или тканей.
Концепция регулируемых/нерегулируемых единиц генома была дополнена данными, согласно которым регулируемые сегменты хроматина могут характеризоваться изменением не только экспрессии генов и времени их репликации в фазе S, но также изменением активности сайтов инициации репликации (oris) [6, 7].
В настоящее время неясен механизм, который обеспечивает одновременное изменение временньго интервала репликации и активности ori(s) в случае одних РД и не обеспечивает этого в случае других РД. Те oris, которые обслуживают нерегулируемый хроматин, относят к конститутивным элементам, а те, которые обслуживают регулируемый хроматин, – к регулируемым [6-8]. Активность первых устанавливается сразу же после начала транскрипции в ходе эмбриогенеза и в дальнейшем не изменяется [8], хотя трансформация нормальных клеток в опухолевые может приводить к небольшому увеличению активности конститутивных oris ─ в 2-3 раза [9]. Активность регулируемых сайтов oris устанавливается в ходе развития организма, по мере реализации генетической/эпигенетической программы. Дополнительные сведения о тканеспецифической активности таких oris были получены лишь в случае в-глобинового локуса человека [10] и локуса IFNA2, содержащего ген интерферона α2 человека [7]. В последней работе один из сайтов (самый активный сайт, обозначенный как ori-1) отличался по активности на 2 порядка в 3-х линиях клеток различного происхождения.
Удобные модели необходимы для выяснения различных механизмов регуляции тканеспецифических oris по времени их активации в фазе S и устанавливаемой активности в ходе эмбриогенеза. Одно из направлений ─ изучение активности тканеспецифических oris в различных типах клеток ─ может позволить выявить район хромосомы, удобный для исследований. Учитывая это и данные по ori-1, мы продолжили ранее начатые исследования этого сайта, расположенного в AT-богатой изохоре хромосомной полосы 9p22 человека, как возможного кандидата. Необходимость дальнейшего исследования ori-1 была продиктована также тем обстоятельством, что, по нашим данным [11], этот элемент может быть использован в качестве важного компонента при создании генно-терапевтических векторов на безвирусной основе, реплицирующихся экстрахромосомно.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Объектом исследования служили линии клеток: HEK293 (DSMZ no.: ACC 305), которая образовалась, по-видимому, из нейрональной клетки на ранней стадии развития [12], и HeLa (DSMZ no.: ACC 57), которая происходит из эпителия шейки матки. В качестве «внутреннего контроля» исследовали линию иммортализовнных фибробластов CH, изученную ранее [11]. Культуры клеток выращивали в среде DMEM (Gibco), с добавлением 10% сыворотки эмбриона теленка (Gibco), 2 мкМ L-глютамина (Gibco) и 100 мкг/мл гентамицина (Gibco) при 37°C в атмосфере 5% CO2. Измерение инициирующей активности исследуемых oris проводили методом К-ПЦР, приложенной к пулу коротких фрагментов новосинтезированной ДНК (800-1,000 п. н.), выделенных из экспоненциально растущих клеток указанных линий, как описано ранее [11]. Для амплификации использовали следующие пары олигонуклеотидов: пару праймеров STS-54.8 (5'AAACCCTGCTTATCTTAAACCAACC + 5’ACTCTGCCCTGCCTTTTATGC), пару 16-22 (5'CAATCAGTTCTCACTAAGGG + 5’AAGGTGTGGCTTGAAACTGCCT) и пару AT2 (5’GGAGCTGTCAAGATTACTACCT + 5’GGATCCTTGGGGATACACAGAA). Температура отжига составляла 64, 62.5 и 62.5єC, соответственно, а длина амплифицируемого участка ─ 75, 70 и 196 п. н. С помощью пар 16-22 и AT2 амплифицировали участки ДНК вблизи ori-1 и выявленного в настоящей работе ori-4, соответственно, которые расположены в пределах локуса IFNA2 (рис. 1А), а с помощью пары STS-54.8 амплифицировали общепринятую контрольную точку, расположенную в β-глобиновом локусе человека (рис. 1Б).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Результаты проведенных исследований (рис. 1) показали, что по сравнению с клетками линии CH в клетках HEK293 инициация репликации ДНК обнаруживается дополнительно в точке AT2, ранее служившей контрольной [7, 11]; в то же время инициация около ori-1 резко падала (примерно в 5 раз). В клетках HeLa инициация репликации около ori-1 сохранялась на довольно высоком уровне (была примерно в 2.5 раза меньше, чем в СН), а в точке AT2 не обнаруживалась, точно также как и в клетках CH. Эти данные показывают, что в исследованном нами районе АТ-богатой изохоры хромосомной полосы 9p22 человека активность oris в разных типах клеток существенно изменяется. Новые результаты демонстрируют, что не только активность одного из сайтов инициации (ori-1) может изменяться в ходе онтогенеза с помощью эпигенетических механизмов (в 5-130 раз с учетом данных [7]), но и могут появляться новые сайты инициации репликации ДНК (например, ori-4), расширяющие участок инициации. Теперь уже не три сайта ori, как установлено ранее [11], а четыре характеризуют локус IFNA2 человека (рис. 1А). Полученные данные дают основание предложить использование IFNA2-содержащую изохору в качестве модели для выяснения особенностей эпигенетических механизмов, определяющих, например, время активации соответствующих oris в фазе S и уровень их активности в ходе эмбриогенеза.
По имеющимся данным, уровень транскрипции, устанавливающийся в ходе развития организма, одновременно определяет уровень активности ori(s) в данной области генома млекопитающих [8]. Этим данным соответствует сочетание высокой активности ori-1 в линиях клеток СН и Jurkat [7, 11] с предполагаемой экспрессией гена IFNA2 в клетках этих линий (так как этот ген экспрессируется в их предшественниках ─ фибробластах и T-лимфобластах; цит. [7]). Аналогично, высокая активность ori-1 в клетках линий HeLa и HEK293 предполагает активность гена IFNA2 в этих клетках.
Оris могут быть важными элементами экстрахромосомно-реплицирующихся генно-терапевтических векторов на безвирусной основе [11]. Полученные данные позволяют предсказать, что эти вектора смогут реплицироваться через посредство ori-1 в довольно широком спектре тканей. Это вытекает из того факта, что этот ori активно функционировал в 4-х из 5 исследованных нами линиях клеток [7, 11 и настоящая работа].
Работа поддержана грантом РФФИ (№ 13-04-00598) и гранта Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология».
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Takebayashi S., Ryba T., Gilbert D. M. // Nucleus. 2012. V. 3. № 6. P. 500-507.
2. Hiratani I., Leskovar A., Gilbert D. M. // Proc Natl Acad Sci U S A. 2004. V. 101. № 48. Р. 16861-1686.
3. Woodfine K., Fiegler H., Beare D. M., Collins J. E., McCann O. T., Young B. D., Debernardi S., Mott R., Dunham I., Carter N. P. // Hum Mol Genet. 2004. V. 13. № 2. P. 191-202.
4. Hiratani I., Ryba T., Itoh M., Rathjen J., Kulik M., Papp B., Fussner E., Bazett-Jones D. P., Plath K., Dalton S., Rathjen P. D., Gilbert D. M. // Genome Res. 2010. V. 20. № 2. P. 155-169.
5. Dixon J. R., Selvaraj S., Yue F., Kim A., Li Y., Shen Y., Shen Y., Hu M., Liu J. S., Ren B. // Nature. 2012. V. 485. № 000. P. 376-380.
6. Gilbert D. M. // Mol. Cell. 2005. V. 20. № 5. P. 657-658.
7. Kholodii G., Dantsevich O., Korobov G., Tarantul V. // Cell Cycle. 2009. V. 8. № 24. P. 4176-4178.
8. Sequeira-Mendes J., Dнaz-Uriarte R., Apedaile A., Huntley D., Brockdorff N., Gуmez M. // PLoS Genet. 2009. V. 5. № 4. e1000446.
9. Rampakakis E., Arvanitis D. N., Di Paola D., Zannis-Hadjopoulos M. // J. Cel. Biochem. 2009. V106. № 4. P. 512–520.
10. Buzina A., Aladjem M. I., Kolman J. L., Wahl G. M., Ellis J. // Nucleic Acids Res. 2005. V. 33. № 14. P. 4412-4424.
11. Kholodii G., Dantsevich O., Tarantul V. // Cell Cycle. 2008. V. 7. № 24. P. 3949-3951.
12. Shaw G., Morse S., Ararat M., Graham F. L. // FASEB J. 2002. V. 16. № 8. P. 869-871.
ПОДПИСЬ К РИС. 1
Дифференциальная активность oris, выявленная в клетках различного происхождения. (А) Местоположение начал репликации, выявленных ранее [11] и в настоящей работе, и сайты для К-ПЦР в локусе INFA2 человека. (Б) Местоположение контрольного сайта для К-ПЦР, расположенного в β-глобиновом локусе человека. (B) Инициирующая активность ori-1 и ori-4 представлена отношением количества инициаций (копий коротких фрагментов новосинтезированной ДНК), найденных с помощью пары праймеров 16-22 или АТ2, к количеству копий ДНК, найденных с помощью пары праймеров STS-54.8, амплифицирующей фоновый участок ДНК. Инициирующая активность в точке STS-54.8, принятой за единицу, была неотличима от таковой в точке AT2 в случае линий клеток HeLa и CH.
