УДК. 577.21
РАЗРАБОТКА ПРАЙМЕРОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ПАТОГЕННЫХ ГРИБОВ РОДА FUSARIUM, ВЫЗЫВАЮЩИХ ФУЗАРИОЗ ЗЕРНОВЫХ КУЛЬТУР
– к. с.-х. н., доцент кафедры биологии и химии Костанайского государственного университета им. А. Байтурсынова
- магистр ветеринарных наук, преподаватель кафедры ветеринарной санитарии Костанайского государственного университета им. А. Байтурсынова
- магистрант, Костанайский государственный университет им. А. Байтурсынова
Диагностика патогенных видов грибов рода Fusarium всегда затруднена в связи с запутанной фенотипической системой классификации. Нами использован метод на основе PCR-Realtime, с разработанными нашей лабораторией праймерами и зондами, который позволяет быстро и точно идентифицировать три патогенных вида грибов Fusarium распространенных на северном Казахстане: Fusarium graminearum, F. culmorum и F. oxysporum. Сочетание быстроты анализа и возможности одновременного тестирования большого количества образцов дают методу PCR-Realtime неоспоримые преимущества перед другими аналитическими методами. Возможности, заложенные в этом методе, позволяют достигать максимальной чувствительности и специфичности анализа, то есть способности надежно и точно детектировать искомые единичные фрагменты генетического материала, в том числе при наличии в пробе ДНК других организмов. Метод основан на ПЦР-амплификации ДНК-фрагментов, которые были разработаны на основе гена фактора элонгации трансляции 1-? (tef1?). Помимо обеспечения точной, надежной и быстрой диагностики грибов рода Fusarium в зерновых культурах, еще одним преимуществом данного метода является то, что он исключает использование канцерогенных веществ (этидиум бромид), таккак в PCR-Real-time используются флуоресцентные меченые зонды, т. е. не требуется проведения гель-электрофореза.
Ключевые слова: ПЦР Real-time, Fusarium graminearum, Fusarium culmorum и Fusarium oxysporum.
DESIGNING HIGHLY SPECIFIC AND SENSITIVE PRIMERS FOR THE
DIAGNOSIS OF PATHOGENIC FUNGI OF THE GENUS FUSARIUM
CAUSING GRAIN FUSARIOSE
BeyshovaI S. - Candidate of Agricultural Sciences, Associate Professor of the Department of Biology and Chemistry of Kostanay State University named after A. Baitursynov
Ulyanov V. A. - Master of Veterinary Science, Lecturer of the Department of Veterinary and Veterinary Sanitation of Kostanai State University named after A. Baitursynov
Kurakova O. S. – Master student, Kostanai State Universit named after A. Baitursynov
Diagnosis of pathogenic species of Fusarium fungi is always difficult due to complicated phenotypic classification system. We have used a method based on PCR-Real time with primers and probes developed by our laboratory which allows to identify quickly and accurately the three pathogenic fungi Fusarium species common in northern Kazakhstan: Fusarium graminearum, F. culmorum and F. oxysporum. The combination of the analysis speed and the simultaneous testing of a large number of samples give PCR-Real time method advantages comparing with other analytical methods. The possibilities of this method allow to achieve maximum sensitivity and specificity of analysis, that is, the ability to detect reliably and accurately individual pieces of genetic material, including the other organisms’ presence in a sample of DNA. The method is based on PCR amplification of DNA fragments, which were designed based on the gene translation elongation factor 1-? (tef1?). In addition to providing an accurate, reliable and rapid diagnosis of fungi of the genus Fusarium in cereals, another advantage of this method is that it avoids the use of carcinogenic substances (ethidium bromide), as in PCR-Real-time fluorescence labeled probes are used, i. e. it does not require gel electrophoresis.
Keywords: PCR Real-time, Fusarium graminearum, Fusarium culmorum and Fusarium oxysporum.
АСТЫ? ДА?ЫЛДАРЫНЫ? ФУЗАРИОЗЫН ТУДЫРАТЫН FUSARIUMТ??ЫМДЫ ПАТОГЕНДІК СА?ЫРАУ??ЛА?ТАРДЫ ДИАГНОСТИКАЛАУ?А АРНАЛ?АН ПРАЙМЕРЛЕРДІ ??РАСТЫРУ
– ауыл шаруашылы?ы ?ылымдарыны? кандидаты, А. Байт?рсынов атында?ы ?останай мемлекеттік университетіні? доценті
- ветеринария гылымыны? магистрі, А. Байт?рсынов атында?ы ?останай мемлекеттік университеті ветеринариялы? санитария кафедрасыны? о?ытушысы
- А. Байт?рсынов атында?ы ?останай мемлекеттік универститетіні? ветеринария ж?не мал шаруашылы? технологиясыны? магистранты
Фенотиптік ж?йесіні? к?рделі болуына байланысты Fusarium т??ымды са?ырау ??ла?тарды? патогендік т?рлерін диагностикалау ?иындай т?сті. Біз полимеразды тізбекті реакцияны? Real time негізіндегі ?дісті бізді? зертханамыз ?зірлеген праймерлермен ж?не зондтармен бірге пайдаланды?, олар Fusarium са?ырау??ла?тарыны? Солт?стік ?аза?станда ке?інен тарал?ан Fusarium graminearum, F. сulmorum ж?не F. oxysporum сия?ты ?ш т?рін жылдам ?рі на?ты диагностикалау?а м?мкіндік береді. Анализді жылдам ж?ргізу ж?не бір мезгілде сынамаларды? к?п м?лшерін тестілеу м?мкіндігі бас?а аналитикалы? ?дістермен салыстыр?анда PCR-Real time ?дісіні? басым арты?шылы?тарын к?рсетеді. Осы т?сілді? м?мкіндіктері анализді? максималды сезімталды?ы мен спецификалы?ына ?ол жеткізуге, я?ни ДН? сынамасында бас?а а?залар бол?анны? ?зінде генетикалы? материалды? ізделініп жат?ан дара фрагменттерін детекциялау?а м?мкіндік береді. Б?л ?діс 1-а трансляция элонгациялау факторы (tef1a) геніні? негізінде ??растырыл?ан ДН?-фрагменттеріні? ПТР-амплификациялау?а негізделген. Асты? да-?ылдарында?ы Fusarium т??ымды са?ырау??ла?тарды д?л, сенімді ж?не жылдам диагностикалауды ?амтамасыз етуден бас?а, осы т?сілді? та?ы бір арты?шылы?ы болып канцерогендік заттарды (этидиум бромид) пайдаланбайтынды?ы табылады, себебі PCR-Real time ?дісінде флуоросценттік та?балан?ан зондтар пайдаланылады, я?ни гель-электрофорезді ж?ргізу талап етілмейді.
Кілт с?здер: ПТР Real-time, Fusariumgraminearum, Fusariumculmorumж?не Fusariumoxysporum.
Введение
Продовольственная и биологическая безопасность в мире во многом зависит от четкого и своевременного контроля над фитосанитарным состоянием окружающей среды и сельскохозяйственных растений, а также продуктов их переработки и кормов. Основным подходом для осуществления такого контроля является эффективная диагностика и идентификация фитопатогенов. Особое внимание должно уделяться диагностике патогенов, являющихся объектами внутреннего и внешнего карантина, а также особо опасным патогенам.
Условия окружающей среды достаточно сильно влияют на видовой состав представителей рода Fusarium в том или ином регионе. Можно сказать, что именно они являются ключевым фактором встречаемости и распространённости патогенов, поскольку возбудители фузариоза не приурочены к какому-либо одному виду растений-хозяев [1]. Долгое время фузариоз рассматривался как заболевание, характерное для зон с тёплым и влажным климатом. Такие условия являются оптимальными для развития гриба F. graminearum, который вызывал наиболее известные эпифитотии фузариоза. Однако позже, с выявлением новых видов, стало ясно, что многие из них характеризуются высокой экологической пластичностью и могут встречаться в регионах с различными климатическими условиями. Тот же F. graminearum в начале 2000-х годов был впервые обнаружен в северных районах Европы (Норвегия, Финляндия, Польша, север Германии) [2], а также на северо-западе России [3]. Видимо, этому благоприятствовало потепление климата, а также развитие механизмов адаптации гриба к более холодным условиям.
Патогенные грибы рода Fusarium, как известно, производят вредные микотоксины в результате чего эти токсинызагрязняют растениеводческую продукцию [4]. Использование пищевой и кормовой продукции, загрязненной микотоксинами представляют большой риск для здоровья человека и животных, так как данные микотоксины являются канцерогенами и могут ослаблять иммунную систему [5]. Вспышки заболеваний, вызываемых этими грибами, представляют собой большую проблему для сельскохозяйственной отрасли и угрожают глобальной продовольственной безопасности [6, 7]. На сегодняшний день существует потребность в точных и быстрых мерах контроля заболеваний, вызываемых этими грибами, так как точная идентификация грибов вида Fusarium всегда была проблематична даже для экспертов микологии.
В последние время более широкое использование молекулярных методов в диагностике грибковых заболеваний растений используется как возможное решение проблемы, связанной с существующей фенотипической идентификационной системой [8, 9]. Одним из самых надежных и информативных методов, используемых в диагностике грибковых заболеваний, является метод ПЦР.
Предлагаемый нами экспресс метод может служить в качестве инструмента для оценки уровня грибкового содержания ДНК в зерновых культурах и оценить риск микотоксинового загрязнения грибами рода Fusarium.
Работа выполнена в рамках научного проекта МОН РК ГФ на 2015-2017 гг. «Разработка высокоспецифичных и чувствительных экспресс-тестов на основе ДНК маркеров для диагностики фузариоза зерновых культур» (Регистрационный № 000РК01591).
Материалы и методы исследования
Выбор специфических праймеров и флуоресцентно-меченых зондов
Поиск нуклеотидных последовательностей для подбора специфических праймеров, осуществляли с помощью онлайн программы GenBank NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/GenBank). Выравнивание нуклеотидных последовательностей было выполнено с использованием алгоритма Clustal W (Thompson et al., 1994). Работоспособность праймеров и зондов проводили с использованием программыOligo 6.71.
Результаты и обсуждение
После анализа последовательностей ДНК Fusarium graminearum, F. culmorum и F. oxysporumв различных базах, данных для подбора специфичных праймеров были выбраны гены фактора элонгации трансляции 1-? (tef1?), ?-тубулина (beta-tubulin), ген фосфатпермеазы (РНО), ген большой субъединицы АТФ-цитратлиазы (acl1), внутренние транскрибируемые (ITS1 и ITS2) и др. Для каждого, из указанных выше генов, был произведен поиск последовательностей, который включал не только целевые организмы, но и группу близкородственных организмов к данному виду. Далее было произведено выравнивание с помощью компонента программы «Vector NTI» – AlignX (рисунок 1).
Рисунок 1 - Выравнивание фрагментов генов tef1? грибов рода Fusarium
(желтым цветом указаны участки полного совпадения нуклеотидов, синим – частичное совпадение, зеленым – 50% совпадений, бесцветные участки – уникальные последовательности)
Специфические участки, подходящие для создания праймеров, были найдены при выравнивании генов tef1? — ген фактора элонгации трансляции 1-? (таблица 1).
Таблица 1. Список олигонуклеотидов, выбранных для идентификации Fusariumgraminearum, F. culmorum и F. oxysporum.
Вид организма | Ген | Праймеры и зонды (Sequence 5'-3') |
Fusariumgraminearum | tef1? | Upperprimer - GGCTTTGTCGTAATTTTTTTCCC |
Lowerprimer – CGGGAGCGTCTGATAGCCA (tggctatcagacgctcccg) | ||
Probe - (BHQ1)-CAGGGAATGGTT(FAMdT)GTGGGAAGAGGGCAGACGC | ||
Fusarium culmorum | tef1? | Upperprimer - CGGCTTTGTCGTAATTTTTCTGG |
Lowerprimer – CGGGAGCGTCTGATAGTCG (cgactatcagacgctcccg) | ||
Probe - (BHQ1)-TAGGGAATGGTT(FAMdT)GTGGGAAGAGGGCAAGCGC | ||
Fusarium oxysporum | tef1? | Upperprimer - AGTACTCTCCTCGACAATGAGC |
Lower primer – TCACAACCTCAATGAGTGCGTC (gacgcactcattgaggttgtga) | ||
Probe - (BHQ1) - TGACTTTGAGAAA(FAMdT)ACCCCGCCAGGTCTTG |
Заключение
Таким образом, разработанные нами праймеры и зонды для диагностики F. oxysporum, F. culmorum и F. graminearum могут использоваться при разработке тест-системы ПЦР в режиме Real-time, которая в свою очередь обеспечивает точное и быстрое обнаружение и количественное определение грибов вида Fusarium.
Литература:
1. Risk assessment models for wheat Fusarium head blight epidemics based on within-season weather data [Текст]/.E. D. De Wolf[et al.] //Phytopathology, 2003. – V.53. - P. 428-435.
2. Weather conditions conducive to Gibberellazeae and Fusariumgraminearum head blight of wheat [Текст] /A. Obst[et al.] //JournalofAppliedGenetics, 2002. – V.43A. - P.185-192.
3. Заражённость грибами рода Fusarium и контаминация микотоксинами зерна овса и ячменя на севере Нечерноземья[Текст]/[и др.] //Сельскохозяйственная биология, 2009. С.89-93.
4. The use of species-speciec PCR based assays to analyse Fusarium ear blight of wheat[Текст]/F. M. Doohan[et al.] //Plant Pathol., 1998. –V.47. - P.197-205.
5. Agonistic and antagonistic e?ects of zearalenone, an estrogenic mycotoxin, on SKN, HHUA, and HepG2 human cancer cell lines[Текст]/G. S.Withanage[et al.]//Vet. Hum. Toxicol., V.43. – P. 6-10.
6. Scab of wheat and barley: a reemerging disease of devastating impact [Текст]/ M. McMullen[et al.] //Plant Dis., 1997. – V.53. - P.1340-1348.
7. Prevalence of fungi and fusariotoxins on barley seed from western Canada, 1995 to 1997[Текст]/R. M. Clear[et al.]//Can. J. Plant Pathol.,2000. – V.22. - P.44-50.
8. Primer sets developed to amplify conserved genes from ?lamentous ascomycetes are useful in di?erentiatingFusarium species associated with conifers[Текст]/G. CDonaldson[et al.]//Appl. Environ. Microbiol., 1995. – V.61. - P.1331-1340.
9. The evolutionary biology and population genetics underlying fungal strain typing[Текст]/J. W. Taylor[et al.]//Clin. Microbiol. Rev., 1999. – V.12. – P.126-146.
10. Дрейпер, Дж. Генная инженерия растений.[Текст] / Дж. Дрейпер, Р. Скотт, Ф. Армитидж, Р. Уолден. – М.: Мир, 1991. -124с.
