Инструкция

DM E-4600 С-реактивный белок

высокочувствительный.

Набор реагентов для ИФА для количественного определения С-реактивного белка (СРБ) в сыворотке.

Только для in-vitro диагностики.

Сбор и хранение образцов:

Для анализа в дублях требуется примерно 0,1 мл сыворотки.

Хранение: при 4?C до 24 часов.

более длительное хранение при – 10 ?C.

Подготовка образцов:

Перед использованием разведите сыворотку в соотношении 1:20 калибратором A.

Пример: К 190 мкл калибратора A добавьте 10 мкл сыворотки.

* Не разбавляйте стандарты и контроли, они готовы к применению.

Необходимые, но не поставляемые материалы и оборудование:

- Прецизионные пипетки с одноразовыми наконечниками на 10, 20, 50, 100, 190, 200 и 300 мкл.

- Дистиллированная или деионизированная вода

- Микропланшетный шейкер

- Микропланшетный анализатор, способный измерять ОП при 450 нм и пределом ОП 3,0 и выше.

Компоненты набора:

Разборный микропланшет, покрытый мышиными анти-СРБ антителами.

Готов к использованию.

Содержит:  Один 96 луночный (12х8) микропланшет покрытый моноклональными антителами в закрывающемся пакете с осушителем.

Хранение: 2-8?С

Стабильность: 12 месяцев или как указано на этикетке

Концентрированный конъюгат  мышиных анти-СРБ антител-HRP – х80

Содержит: конъюгат  анти-CRP моноклональных антител-HRP в белковом основном буферном растворе с консервантом не содержащем ртуть.

Объём:  0,3 мл/флаконе

Хранение: 2-8?С

Стабильность: 12 месяцев или как указано на этикетке

Способ приготовления: развести 1:80 с буфером для анализа перед использованием (например. 25 мкл концентрата в 2 мл буфера). Если будет использоваться весь планшет то нужно развести 150 мкл концентрата в 12 мл буферного раствора для анализа. Не использовать, что осталось.

CRP-калибраторы

Готовы к использованию.

Содержат: шесть флаконов с CRP в основном белковом буфере с консервантом не содержащем ртуть. Содержат заданные концентрации CRP в буферном растворе. Калибраторы изготовлены согласно рекомендациям ВОЗ 1st IS 85/506.

Ниже приведены примерные концентрации, пожалуйста, обратитесь к этикетке на флаконе  для точной концентрации:

Калибратор	Концентрация	Объём/флаконе
Калибратор A	0 нг/мл	16,0 мл
Калибратор B	100 нг/мл	0,5 мл
Калибратор C	400 нг/мл	0,5 мл
Калибратор D	1000 нг/мл	0,5 мл
Калибратор E	4 000 нг/мл	0,5 мл
Калибратор F	10 000 нг/мл	0,5 мл

Хранение: 2-8?С

Стабильность: 12 месяцев или как указано на этикетке. Открытые стандарты или аликвоты должны быть использованы в течение 14 дней или заморожены. Избегайте повторных циклов замораживания/оттаивания.

Контроль. Готов к использованию.

Содержит: один флакон с CRP в основном белковом буфере с консервантом не содержащем ртуть. Содержит заданную концентрацию CRP в буферном растворе. Концентрация указана на этикетке флакона.

Объём: 0,5 мл

Хранение: 2-8?С

Стабильность: 12 месяцев или как указано на этикетке. Открытые стандарты или аликвоты должны быть использованы в течение 14 дней или заморожены. Избегайте повторных циклов замораживания/оттаивания.

Концентрат промывочного буфера – x10

Содержит: 1 бутыль с не ионным промывочным раствором и консервантом не содержащим ртуть.

Объём: 50 мл/бутыль

Хранение: 2-8?С

Стабильность: 12 месяцев или как указано на этикетке

Способ приготовления: Перед использованием разведите дистиллированной или деионизированной водой 1:10. Если будет использован весь планшет, то разбавьте 50 промывочного буфера с 450 мл воды.

Буфер для анализа – Готов к использованию

Содержит: 1 флакон, содержащий основной белковый буферный раствор с консервантом, не содержащим ртуть.

Объём: 40 мл/флаконе

Хранение: 2-8?С

Стабильность: 12 месяцев или как указано на этикетке

ТМБ-субстрат – Готов к использованию

Содержит: Один флакон, содержащий тетраметилбензидин и перекись водорода в не - DMF или DMSO содержащем буфере.

Объём: 16 мл/флаконе

Хранение: 2-8?С

Стабильность: 12 месяцев или как указано на этикетке

Стоп-раствор

Содержит: 1 флакон, содержащий 1 М серной кислоты.

Объём: 6 мл/флаконе

Хранение: 2-8?С

Стабильность: 12 месяцев или как указано на этикетке

Процедура анализа

Перед использованием разведите сыворотку в соотношении 1:20 калибратором A.

Перед использованием все реагенты должны достичь комнатной температуры. Стандарты, контроли и образцы проб должны быть исследованы в дублях. Как только процедура начата, все этапы должны быть завершены без перерыва.

Приготовьте рабочие растворы CPR-HRP конъюгата и промывочного буфера. Извлеките необходимое количество стрипов. Неиспользованные  поместите обратно в упаковку, герметично закупорьте и поместите в холодильник. Добавьте по 20 мкл калибраторов, контролей и разведенных образцов в соответствующие лунки микропланшета. Добавьте по 200 мкл Буфера для анализа в каждую лунку (мы рекомендуем использовать многоканальную пипетку). Инкубируйте в шейкере (200 об/мин.) при комнатной температуре 30 минут. Промойте каждую лунку по 3 раза: внося по 300 мкл раствора промывочного буфера, удаляя остатки влаги абсорбирующей бумагой (мы рекомендуем использовать вошер). Добавьте по 100 мкл рабочего раствора конъюгата в каждую лунку. Инкубируйте в шейкере (200 об/мин.) 15 минут при комнатной температуре. Промойте каждую лунку, так же как и в этапе 6. Добавьте по 100 мкл ТМБ-субстрата в каждую лунку через заданные интервалы времени Инкубируйте 15-20 минут в шейкере при комнатной температуре (или до того момента, когда калибратор F не станет темно-синим, достигнет нужной ОП) Добавьте 50 мкл Стоп-раствора в каждую лунку, через те же промежутки времени, что и в этапе 10. Определите результат на микропланшетном анализаторе при 450 нм в течение 20 минут после добавления Стоп-раствора. Если ОП превышает верхний предел обнаружения или  фильтр  450 нм недоступен, то можно заменить на фильтр 405 или 415nm. Оптические плотности будут ниже, однако, это не повлияет на результаты пациентов/контрольные пробы.

Расчет результатов

рассчитайте среднюю оптическую плотность каждого калибратора в дублях рассчитайте среднюю оптическую плотность каждого неизвестного в дублях. Вычтите среднее значение абсорбции "0" калибратора из средних значений оптической плотности калибраторов, контроля и образцов сыворотки. Нарисуйте калибровочную кривою на логарифмической бумаге со средней оптической плотности на Y-оси  и концентрацией калибратора на X-оси. Если для анализа используется программное обеспечение, то рекомендуется кривая на 4-параметра. Рассчитайте значение неизвестных при помощи калибровочной кривой. Если образец получается более 10 000 нг/мл, то разведите его Калибратором A в соотношении не более 1:10. Полученный результат следует умножить на фактор разведения.

5. Типичная таблица данных (не используйте для расчета)

Калибратор	ОП 1	ОП 2	Средняя ОП	Концентрация (нг/мл)
A	0.055	0.053	0.054	0
B	0.105	0.103	0.104	100
C	0.271	0.276	0.274	400
D	0.607	0.633	0.620	1000
E	1.964	1.894	1.929	4 000
F	2.829	2.827	2.828	10 000
Неизвестная	1.035	1.048	1.042	1737

Типичная калибровочная кривая (не используйте для расчета)

см. оригинал инструкции.

Чувствительность: 10 нг/мл

Ожидаемые нормальные значения:

Это же касается всех клинических анализов, каждая лаборатория должна собирать данные и создавать свои собственные диапазоны ожидаемых нормальных значений.

Мужчины	Женщины	Общая группа
N	43	45	88
Возраст	17-87	12-79	12-87
Диапазон	73 - 63 680	34 – 39 240	34 - 63 680
2,5 перцентиля	132	139	135
50 перцентиля	1197	1033	1104
97,5 перцентиля	9710	6578	8910